體外不同誘導條件對骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchyma stem cells，MSCs)和心肌細胞(cardiomyocytes，CM)的分離、培養(yǎng)及5-氮胞苷(5-Aza)和共培養(yǎng)兩種方法對MSCs誘導分化為CM的作用；不同方法誘導MSCs分化后，MSCs在不同時間段分化為CM的能力及表達心肌細胞特異性標記物縫隙連接蛋白43(Cx43)、肌鈣蛋白T(cTnT)的差別，為MSCs移植治療急性心肌梗死(acute myoc

2、ardial infarction，AMI)提供一定的理論基礎。
　　 方法：在無菌條件下分離Wistar大鼠股骨骨髓，采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法相結合進行MSCs培養(yǎng)、純化和擴增，并行透射電鏡鑒定。在無菌條件下分離同種乳鼠心臟，采用差速貼壁法進行CM培養(yǎng)、純化并行Cx43、cTnT的免疫細胞化學檢測。在獲得穩(wěn)定的細胞系后，選取生長良好的第三代MSCs用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記，分三組：①正常對照組：DA

3、PI-MSCs在普通培養(yǎng)基中生長；②5-Aza誘導組：DAPI-MSCs加入5-Aza誘導，用不同濃度5-Aza分別作用不同時長，以觀察最佳濃度和作用時間并行免疫組化鑒定cTnT、Cx43；③共培養(yǎng)組：與培養(yǎng)第3天的CM共培養(yǎng)。培養(yǎng)后1w、2w、3w、4w在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)結構變化及免疫細胞化學染色鑒定cTnT、Cx43，并計算其誘導陽性率。
　　 結果：Wistar大鼠MSCs經(jīng)過分離、貼壁、純化能在體外進行增

4、殖并保持良好的未分化潛能。同種乳鼠CM分離、貼壁后1天即能出現(xiàn)自發(fā)性搏動，培養(yǎng)2～3d可長成單層并形成細胞簇，并出現(xiàn)成簇細胞的同步搏動。經(jīng)10μmol/L5-Aza持續(xù)作用15天的MSCs，4w時呈現(xiàn)出心肌細胞的典型改變，并有部分細胞出現(xiàn)自發(fā)搏動，頻率為15～20次/分。MSCs傳至第3代時用DAPI標記，標記效率為100％，DAPI-MSCs在正常培養(yǎng)基中未見有細胞收縮，cTnT、Cx43表達陰性；在誘導組和共培養(yǎng)組，培養(yǎng)至4w時細胞

5、排列方向一致，成肌性排列，部分細胞呈現(xiàn)搏動，誘導1w時cTnT、Cx43表達陰性，誘導2w時cTnT陽性率為(9.98±1.67)％，Cx43陽性率為(13.38±2.15)％，培養(yǎng)至4w時陽性率升高，而且與3w，2w相比(P＜0.01)；共培養(yǎng)組第5天cTnT、Cx43就開始表達了，隨著培養(yǎng)時間延長，陽性率逐漸升高，到第4w時cTnT、Cx43陽性率分別為(88.3±1.33)％，(90.38±1.87)％，與3w，2w，1w相比(P