低糖應(yīng)激條件下TIGAR依存的自噬調(diào)控失衡參與介導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制研究.pdf

1、血腦屏障(BBB)是位于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)之間的一個動態(tài)而復(fù)雜的屏障結(jié)構(gòu)。血腦屏障表達(dá)有其特有的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以調(diào)節(jié)各種物質(zhì)進(jìn)出腦實(shí)質(zhì)。血腦屏障由一層緊密連接沒有開口的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，并含有低水平的吞飲小泡以及由緊密連接和粘附連接組成的連接復(fù)合體。作為保護(hù)腦實(shí)質(zhì)的重要屏障，維護(hù)BBB的結(jié)構(gòu)及功能正常極其重要。
　　葡萄糖是腦部最重要的養(yǎng)分，腦組織不能生產(chǎn)也無法儲存葡萄糖，必須依賴血液中的葡萄糖不斷地供應(yīng)，人體每天產(chǎn)

2、生的葡萄糖至少有一半是提供腦部使用。低血糖癥指的是由血糖含量過低引發(fā)的臨床醫(yī)療癥狀。來自于臨床的資料顯示，即使是血糖持續(xù)低下單一因素，也足以引起大腦功能障礙。當(dāng)血糖太低時，腦部缺乏葡萄糖，將使大腦代謝受到嚴(yán)重影響，輕則反應(yīng)遲鈍，重則昏迷甚至神經(jīng)細(xì)胞死亡。實(shí)際上，血糖過低會破壞腦血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，導(dǎo)致罹患腦血管疾病風(fēng)險增加。目前尚無徹底消除由低血糖引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞連接破壞和神經(jīng)血管損傷的調(diào)控手段，因此十分有必要探究并闡釋由低血糖介導(dǎo)的血

3、腦屏障損傷機(jī)制。
　　自噬是一個機(jī)體內(nèi)自發(fā)的降解機(jī)制，包括細(xì)胞質(zhì)成分的溶酶體降解等過程，為細(xì)胞的重要生命活動提供能量和關(guān)鍵成分。在人類的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬在正常生理狀態(tài)下主要發(fā)揮清除代謝產(chǎn)物，改善細(xì)胞存活環(huán)境的功能。但是在內(nèi)皮細(xì)胞受到持續(xù)應(yīng)激源影響時，包括腦缺血、葡萄糖剝奪、缺氧和活性氮成分等，則自噬可能被過度誘發(fā)而出現(xiàn)對細(xì)胞的消極影響。大量證據(jù)證明自噬和細(xì)胞凋亡也許在時間先后上存在一定的關(guān)聯(lián)，自噬的反常可能導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)，甚

4、至促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。LC3(microtubule-associated protein1light chain3)是細(xì)胞內(nèi)重要的自噬標(biāo)志物，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3-Ⅰ可能脂化反應(yīng)為LC3-Ⅱ的形式，而LC3-Ⅱ被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞啟動自噬反應(yīng)的指示器。盡管有證據(jù)證明自噬在神經(jīng)退行性疾病過程中出現(xiàn)上調(diào)，但是對低血糖應(yīng)激下大腦內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的自噬作用的增強(qiáng)或抑制的變化規(guī)律還不清楚，對其相關(guān)作用的理解還是知之甚少。
　　過氧亞硝基陰離子(ONOO

5、-)屬于活性氮物種之一，由機(jī)體內(nèi)一氧化氮(NO）和超氧陰離子(O2-)反應(yīng)產(chǎn)生。ONOO-通過使蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸硝化和過氧化物酶泛素化以抑制前列環(huán)素合酶活性。前期也發(fā)現(xiàn)硝化應(yīng)激在缺血性腦損傷過程中可以調(diào)控自噬過程。大量證據(jù)顯示腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是硝化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病及其并發(fā)癥過程中的主要作用靶細(xì)胞。盡管了解到在神經(jīng)血管的損傷和血腦屏障破壞的病理過程中，由硝化應(yīng)激引發(fā)的促進(jìn)自噬過程和蛋白質(zhì)破壞是重要環(huán)節(jié)，但是其作用機(jī)制尚不清楚。
　

6、　TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)存在磷酸激酶2活性，通過促進(jìn)磷酸戊糖途徑來水解細(xì)胞水平的果糖-2，6-二磷酸(fructose-2，6-bisphosphate)和果糖-1，6-二磷酸(fructose-1，6-bisphosphate)，達(dá)到抑制糖酵解作用的目的。同時，TIGAR可以激活線粒體呼吸鏈反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞在缺氧條件下的氧化還原代謝作用，促進(jìn)細(xì)胞生存。

7、近期研究表明TIGAR對腦缺血損傷顯示出一定的保護(hù)作用，主要是通過增加細(xì)胞NADPH水平和促進(jìn)抗氧化活性以限制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體自噬過程。然而，TIGAR在低血糖應(yīng)激下調(diào)節(jié)腦內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞過程發(fā)揮保護(hù)作用和其潛在的機(jī)制仍然不清楚。目前的研究工作目標(biāo)是闡明由代謝應(yīng)激介導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接損傷的分子機(jī)制，研究重點(diǎn)之一則是解析TIGAR在自噬和大腦內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程之間所扮演的角色。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，深入研究了T

8、IGAR在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中低血糖應(yīng)激發(fā)生時的作用。發(fā)現(xiàn)，在低血糖狀況下，TIGAR扮演的是敏感生物傳感器的角色。利用蛋白免疫印跡分析，對無糖培養(yǎng)基另加葡萄糖的條件下24小時培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分析，可觀察到TIGAR表達(dá)量伴隨葡萄糖濃度增高而增高。此外，在低糖條件下細(xì)胞內(nèi)TIGAR表達(dá)量隨著時間延長而增強(qiáng)，但在24小時后較正常對照組相比出現(xiàn)下降。
　　在培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中，緊密連接蛋白質(zhì)如Claudin-5和occludi

9、n的表達(dá)量是反映腦屏障通透性的關(guān)鍵因素。通過在免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)使用抗TIGAR抗體觀察到了TIGAR的亞細(xì)胞定位。在內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼Claudin-5的GFP慢病毒載體(GFP-Claudin-5)后，在大腦內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處觀察到了強(qiáng)GFP熒光。免疫組化圖像分析顯示了在內(nèi)皮細(xì)胞中TIGAR和Claudin-5存在共定位。同時，在低血糖應(yīng)激下，觀察到occludin和JAM-A蛋白出現(xiàn)時間和濃度依賴性的分解片段增加，伴有JNK磷酸化作用

10、增強(qiáng)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)的上調(diào)。在對照條件下，顯示TIGAR在大腦內(nèi)皮緊密連接的亞細(xì)胞定位，然而在低血糖損傷24小時后，TIGAR表達(dá)量大量減少且緊密連接也失去了完整性。此后，又詮釋了TIGAR在低糖條件誘導(dǎo)的大腦內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的潛在作用。人類腦血管內(nèi)皮細(xì)胞在24小時低血糖條件刺激后再分別轉(zhuǎn)染空載體，重組人類TAT-TIGAR和慢病毒-GFP-TIGAR，結(jié)果顯示TIGAR過表達(dá)可以抑制occludin和JAM-A的降解。

11、r>　　進(jìn)一步，采用形態(tài)學(xué)技術(shù)評估了TIGAR對由低血糖引發(fā)的緊密連接損傷的保護(hù)作用。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示了occludin在大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。在低血糖刺激下，occludin在細(xì)胞質(zhì)膜呈現(xiàn)彌散性分布。TIGAR的過表達(dá)抑制occludin降解并保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處的完整性。之后用電子顯微鏡顯示了內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處的超微結(jié)構(gòu)。在正常對照情況下，內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接通常出現(xiàn)在細(xì)胞與細(xì)胞相接觸的區(qū)域，然而這種緊密連接結(jié)構(gòu)會隨著低

12、血糖應(yīng)激增強(qiáng)而被破壞。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)中LV-TIGAR的過表達(dá)則可抑制細(xì)胞間緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的異常破壞。這些結(jié)果表明了TIGAR可以減輕低糖應(yīng)激條件下緊密連接的損害。
　　為了研究緊密連接外膜上在自噬過程中與TIGAR結(jié)合的分子物質(zhì)，使用了質(zhì)譜檢測方法，其中檢測出29種蛋白質(zhì)具有高置信度，可能與自噬中結(jié)合TIGAR相關(guān)。進(jìn)一步，采用免疫共沉淀技術(shù)確認(rèn)了鈣調(diào)素和TIGAR的相互作用關(guān)系。為了檢測鈣調(diào)蛋白結(jié)合至TIGAR上的實(shí)時動態(tài)

13、變化，確認(rèn)活細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否具有直接相互作用，進(jìn)一步利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)。主要以分析檢測CFP標(biāo)志的鈣調(diào)蛋白(CaM-CFP)和YFP標(biāo)志的TIGAR蛋白(TIGAR-YFP)變化規(guī)律。觀察在CFP熒光（受體）降低時，YFP熒光（供體）出現(xiàn)急劇上升。
　　基于硝化應(yīng)激的發(fā)生依存于鈣/鈣調(diào)素的活性水平，推測低糖應(yīng)激條件下硝化應(yīng)激介導(dǎo)的TIGAR功能障礙可能與酪氨酸殘基硝基化相關(guān)。低血糖應(yīng)激引發(fā)的mRFP-G

14、FP-LC3斑點(diǎn)形成可以被鈣調(diào)素抑制劑W7(1μM)和ONOO-清除劑Melatonin(100nM)而減弱。進(jìn)一步，根據(jù)質(zhì)譜分析確認(rèn)TIGAR蛋白的Y92位點(diǎn)很有可能是發(fā)生硝基化的酪氨酸殘基位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)TIGAR的過表達(dá)可以增加NADPH含量水平，保護(hù)occludin蛋白，而Y92A位點(diǎn)突變后的TIGAR不再能有效保護(hù)內(nèi)皮緊密連接。在低血糖應(yīng)激條件下TIGAR對自噬過程的調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步被證明是抑制了自噬體的形成，因?yàn)橄鄬τ?/p>

15、在24小時低血糖應(yīng)激下的內(nèi)皮細(xì)胞模型內(nèi)的熒光斑點(diǎn)，轉(zhuǎn)染入突變的TIGAR反而更能增強(qiáng)mRFP-GFP-LC3熒光斑點(diǎn)?？偟膩碚f，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了TIGAR在對抗低血糖應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷時通過保護(hù)內(nèi)皮緊密連接的完整性和調(diào)節(jié)自噬過程來保護(hù)血腦屏障。而在這其中，由于其與鈣調(diào)素結(jié)合的特點(diǎn)，使得TIGAR自身極易于成為ONOO-的損傷靶分子。因?yàn)镺NOO-形成非常依賴于鈣/鈣調(diào)素，而快速形成的ONOO-局部高濃度微環(huán)境極易對周邊蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基

16、造成損傷。
　　最后，在胰島素誘導(dǎo)低血糖的小鼠動物模型上同樣驗(yàn)證了TIGAR的保護(hù)作用。TIGAR過表達(dá)來對抗低血糖應(yīng)激作用的效果可以用正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)分析觀察。在低血糖條件下野生型小鼠對FDG的攝取增強(qiáng)，而TIGAR轉(zhuǎn)基因小鼠在低血糖條件下對FDG的標(biāo)準(zhǔn)攝取值則極為微量，這一現(xiàn)象表明了TIGAR過表達(dá)在低血糖應(yīng)激條件下可以通過磷酸戊糖途徑代償性改善腦內(nèi)葡萄糖水

17、平，以保護(hù)內(nèi)皮緊密連接。更進(jìn)一步，在低血糖誘導(dǎo)損傷的對照組動物相比，TIGAR轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出的血管保護(hù)作用主要是通過抑制Claudin-5降解作用而達(dá)到維護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性而達(dá)到的。通過的電子顯微鏡檢測也在小鼠腦皮層得到相似的結(jié)果，胰島素誘導(dǎo)的低血糖應(yīng)激的小鼠模型體內(nèi)的腦微血管損傷可以被TIGAR基因過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。
　　本研究明確了低血糖應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)硝化應(yīng)激，調(diào)控自噬的TIGAR信號之間的相互關(guān)聯(lián)作用。我們

18、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋了低血糖應(yīng)激觸發(fā)的TIGAR表達(dá)下調(diào)可以誘發(fā)內(nèi)皮緊密連接的損傷作用，而TIGAR過表達(dá)則可以通過限制過度自噬保護(hù)內(nèi)皮緊密連接的完整性。而低血糖應(yīng)激條件可以觸發(fā)硝化應(yīng)激，通過TIGAR酪氨酸殘基硝基化而導(dǎo)致TIGAR失活，最終導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用喪失。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡釋了TIGAR通過調(diào)控磷酸戊糖途徑，增加NADPH產(chǎn)量，抑制過度自噬通路，最終表現(xiàn)對腦血管的保護(hù)作用。抑制硝化應(yīng)激或提高TIGAR水平為腦血管疾病的預(yù)防和