多靶點抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的肝素衍生物研究.pdf

1、本課題將以RO-Heparin為基礎(chǔ)，進一步探究肝素乙二醇斷裂程度和分子量對腫瘤轉(zhuǎn)移活性的影響及其分子作用機制，旨在闡明乙二醇斷裂肝素衍生物抗腫瘤生長轉(zhuǎn)移活性的構(gòu)效關(guān)系。實驗通過控制肝素IdoA2S不同程度2-O-脫硫酸、高碘酸氧化/硼氫化鈉還原，得到三種不同乙二醇斷裂程度(glycol split，Gs)的肝素衍生物，分別記為HP-sp(Gs，25％)，HP-30min-sp(Gs，54％)和HP-60min-sp(Gs，75％);大

2、分子量的乙二醇斷裂衍生物僅進行乙二醇斷裂，中分子和小分子肝素乙二醇斷裂衍生物系經(jīng)亞硝酸降解、Sephadex G-10分離獲得，分別記為B-HP-sp、M-HP-sp、S-HP-sp、B-HP-30min-sp、M-HP-30min-sp、S-HP-30min-sp、B-HP-60min-sp、M-HP-60min-sp和S-HP-60min-sp;還以達肝素(5500-6500Da)為原料，經(jīng)高碘酸氧化、硼氫化鈉還原得到乙二醇斷裂程度

3、為25％左右的衍生物，記為M402。
　　本研究取得的結(jié)果及結(jié)論有以下幾個方面:
　　1.肝素衍生物的制備
　　通過控制IdoA2S堿性脫硫酸的反應(yīng)時間，得到不同程度脫硫酸的肝素衍生物，進一步高碘酸氧化還原后獲得不同乙二醇斷裂程度的肝素衍生物，建立了乙二醇斷裂肝素衍生物的系統(tǒng)性制備方法。Gs分別為25.16％、54.26％和74.97％，記為HP-sp，HP-30min-sp和HP-60min-sp，收率分別為80.4

4、％、59.5％和69％。
　　為獲得不同分子量的乙二醇斷裂肝素衍生物，采取亞硝酸降解(pH2.8和pH2.0)、SephadexG-10柱截取獲得不同分子量組分。選擇進行后續(xù)評價的衍生物如下:HP(Mw,16460Da), M402(Mw,5045Da), B-HP-sp(Mw,13736Da),M-HP-sp(Mw,5682Da), S-HP-sp(Mw,4124Da), B-HP-30-sp(Mw,11510Da),M-HP-

5、30-sp(Mw,5694Da),S-HP-30-sp(Mw,3998Da),B-HP-60-sp(Mw,10802Da),M-HP-60-sp(Mw,4396Da),S-HP-60-sp(Mw,3828Da)。
　　2.肝素衍生物的結(jié)構(gòu)分析
　　采用1H-NMR和13C-NMR進行肝素衍生物結(jié)構(gòu)的確證。M402、HP-sp、HP-30min-sp和HP-60min-sp在δ3.40左右GlcA的H2，H3信號消失證明非硫酸

6、化糖醛酸C2-C3鍵斷裂;運用13C-NMR定量計算乙二醇斷裂程度，M402、HP-sp、HP-30min-sp和HP-60min-sp的Gs分別為24.84％、25.16％、54.26％和74.97％。
　　應(yīng)用多角度激光散射法(MALLS)測定肝素衍生物的分子量。測定結(jié)果如下:HP(Mw,14320Da),M402(Mw,5163Da),B-HP-sp(Mw,13830Da),M-HP-sp(Mw,6165Da), S-HP-

7、sp(Mw,4406Da), B-HP-30-sp(Mw,11150Da),M-HP-30-sp(Mw,5743Da),S-HP-30-sp(Mw,4006Da),B-HP-60-sp(Mw,8690Da), M-HP-60-sp(Mw,4179Da), S-HP-60-sp(Mw,3673Da)。與GPC-HPLC測量結(jié)果相比，HP、HP-30-sp和HP-60-sp分子量偏低，其他結(jié)果相近。
　　通過對肝素衍生物200-800

8、nm紫外掃描，證明對肝素的化學修飾未引進其他的共軛發(fā)色團。采用SAX-HPLC對肝素衍生物進行寡糖結(jié)構(gòu)和雙糖組成分析，其中非硫酸化雙糖結(jié)構(gòu)ⅣS，ⅡA，ⅣA含量為零，硫酸化雙糖結(jié)構(gòu)ⅠS，ⅠA，ⅢS含量為HP-sp＞HP-30min-sp＞HP-60min-sp。寡糖結(jié)構(gòu)分析表明，肝素的化學修飾未破壞肝素的母體結(jié)構(gòu)。
　　3.肝素衍生物的體外抗腫瘤活性和抗凝活性的研究
　　3.1肝素衍生物對腫瘤細胞增殖的影響
　　采用四甲

9、基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測了肝素衍生物對腫瘤細胞SKOV-3、HT-29和B16-F10體外增殖的影響。各肝素衍生物有效抑制SKOV-3和B16-F10細胞增殖，而對HT-29的影響較小。各肝素衍生物對腫瘤細胞的增殖未表現(xiàn)出明確的構(gòu)效關(guān)系，實驗發(fā)現(xiàn)B-HP-60-sp在500μg/mL時對三種細胞均有較強的抑制率(p＜0.05)，值得進一步體內(nèi)和體外研究。
　　3.2肝素衍生物拮抗P-Fc與HL-60細胞結(jié)合
　　運用流

10、式細胞術(shù)考察了肝素衍生物對重組P-選擇素/Fc嵌合蛋白(P-Fc)與HL-60細胞結(jié)合的影響。5 mg/mL濃度時，M402、HP、B-HP-sp、B-HP-30-sp、B-HP-60-sp和M-HP-60-sp表現(xiàn)出了顯著的抑制活性，抑制率分別為68.08％、81.22％、79.27％、70.32％、76.13％和79.12％。
　　3.3肝素衍生物抑制HPA活性
　　此外，體外檢測了肝素衍生物對HPA活性的影響。10μg

11、/mL濃度時，肝素衍生物除B-HP-60-sp、M-HP-60-sp和S-HP-60-sp外均能顯著抑制HPA對HS的降解。相同乙二醇斷裂程度不同分子量的衍生物中，HPA抑制活性差異不顯著。HP的抑制活性最強，明顯強于M402(p＜0.05)。
　　3.4肝素衍生物抑制腫瘤細胞的體外侵襲
　　采用Transwell侵襲實驗研究肝素衍生物對腫瘤細胞體外侵襲能力的影響。與空白對照相比，各肝素衍生物在200μg/(9×104)ce

12、lls時均可以抑制SKOV-3細胞的體外侵襲(P＜0.05)。結(jié)果表明，隨著乙二醇斷裂程度增大，肝素衍生物抑制腫瘤細胞體外侵襲能力減弱，而分子量的影響則相對較小。
　　3.5肝素衍生物的體外抗凝活性
　　采用激活部分促凝血酶原激酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)法測定各肝素衍生物的抗凝活性。各肝素衍生物與UFH相比抗凝活性明顯降低，且乙二醇斷裂程度越高、分子量越小，

13、肝素衍生物的抗凝活性越低。
　　4.肝素衍生物體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的評價
　　利用小鼠黑色素瘤肺部轉(zhuǎn)移模型，考察了6種肝素衍生物的體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移情況。與模型給N.S.組相比，各肝素衍生物在15 mg/kg·d劑量下均能明顯抑制小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(P＜0.05)，同時發(fā)現(xiàn)肝素衍生物有抑制腫瘤細胞肝腸轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果表明，肝素衍生物乙二醇斷裂程度越大、分子量越小，抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性越小，以HP和B-HP-SP抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性最優(yōu)。

14、>　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HP組中HPA、P-selectin和CD31表達明顯減弱，M402和B-HP-sp組中HPA、P-selectin表達明顯減弱，而B-HP-30-sp和M-HP-60-sp僅P-selectin的表達明顯減弱。結(jié)果表明，肝素衍生物對HPA、P-selectin和CD31表達的抑制與其抑制肺部轉(zhuǎn)移活性相關(guān)。
　　HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HP組髓竇擴張、充血，脾臟體積和重量明顯增大。關(guān)于引起脾重增加的原因以及肝素的

15、抗腫瘤活性與其所引起的脾臟腫大現(xiàn)象是否存在一定聯(lián)系，均有待于進一步研究。B-HP-sp在眾多肝素衍生物中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，而且抗凝活性很弱，可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的候選化合物。
　　5.課題總結(jié)及創(chuàng)新
　　(1)本課題建立了制備不同乙二醇斷裂程度肝素衍生物的方法，在最小程度地破壞肝素糖鏈分子完整性的前提下，顯著降低了其抗凝活性，解決了肝素用于腫瘤治療存在出血危險的難題。
　　(2)對制備獲得的各肝素衍生物進行結(jié)構(gòu)分析及抗凝活性

16、的測定，表明乙二醇斷裂和糖鏈斷裂均顯著影響肝素的抗凝活性，隨著乙二醇斷裂程度增大和分子量降低，抗凝活性隨之降低。
　　(3)對各肝素衍生物進行體外抗腫瘤活性的評價，以HP和M402為對照。MTT和P-選擇素活性抑制實驗中，各肝素衍生物未表現(xiàn)出明顯的構(gòu)效關(guān)系;HPA抑制實驗中，肝素衍生物能夠抑制HPA的活性，且發(fā)現(xiàn)乙二醇斷裂程度越大、分子量越小，對HPA的抑制活性越小;Transwell侵襲實驗進一步確證了肝素衍生物抗腫瘤轉(zhuǎn)移機制，

17、且乙二醇斷裂程度是影響腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素，而分子量對其影響相對較小。
　　(4)體內(nèi)評價結(jié)果中，HP、B-HP-sp和M402在體內(nèi)評價中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性;免疫組化檢測表明，肝素衍生物對HPA、P-selectin和CD31表達的抑制與其抑制肺部轉(zhuǎn)移活性相關(guān)。
　　(5) HE染色發(fā)現(xiàn)，HP組脾臟體積明顯增大，其作用有待進一步評價。
　　本課題以乙二醇斷裂肝素衍生物為基礎(chǔ)，制備了不同乙二醇斷裂程度和分