痢疾桿菌福氏5型M90T株毒力相關膜蛋白復合物的分離鑒定.pdf

1、痢疾桿菌是一種革蘭氏陰性病原菌,通過各種分泌系統(tǒng)將毒力蛋白分泌到外部環(huán)境或者直接注入宿主細胞。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ⅰ型到Ⅵ型共六種類型分泌系統(tǒng),都是由單個蛋白或者大分子復合物形成一個跨越細菌細胞膜的通道。由于膜蛋白復合物結(jié)構(gòu)復雜、疏水性強,難以從疏水的細胞膜脂雙層中完整地分離純化,因此長期以來對其研究局限于將可能的結(jié)構(gòu)蛋白一個個單獨進行結(jié)構(gòu)和功能研究,缺乏整體性。近年來由Shaegger等人建立并逐漸成熟的藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Blue

2、 Native PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,BN PAGE)為復合物研究帶來新的突破。在痢疾桿菌的致病過程中,毒力大質(zhì)粒編碼許多侵襲相關蛋白比如Ⅲ型分泌系統(tǒng)復合物及其分泌的毒力因子,它的缺失會導致痢疾桿菌毒性的喪失。其細胞膜上除Ⅲ型分泌系統(tǒng)復合物之外,不僅還有5種類型分泌系統(tǒng)復合物未被分離鑒定,還可能有其它一些完全未知的復合物。
　　 本研究通過藍色非變性凝膠電泳(BN PAGE)比較痢

3、疾桿菌福氏5型野生株M90T和大質(zhì)粒缺失株M90T△T的膜蛋白復合物,發(fā)現(xiàn)一個野生株特有的復合物,其分子量約為290kDa,命名為M90T-290。通過第二向SDS-PAGE分離M90T-290得到6個蛋白亞基,質(zhì)譜鑒定為:一個由大質(zhì)粒編碼的毒力蛋白apyrase(ATP-二磷酸水解酶)和5個染色體編碼的蛋白,分別為ClpB、DnaK、hypothetical protein S1768、translation elongation f

4、actor Tu、Rlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas。M90T-290這個復合物是通過染色體和毒力大質(zhì)粒的共同調(diào)控來實現(xiàn)M90T的致病性。
　　 鑒定出復合物的組成蛋白后,決定用標簽親和純化技術對復合物的組成進行了驗證。將apyrase的編碼基因phoN2插入表達GST標簽的PGEX6p-1載體,構(gòu)建成功apyrase-GST融合表達載體,轉(zhuǎn)入M90T中,命名為M90T-6p-apy；

5、制備該轉(zhuǎn)化菌的膜蛋白復合物樣品,用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和柱純化含GST標簽的蛋白,利用BN PAGE分離純化產(chǎn)物。結(jié)果沒有分離得到GST-apyrase融合蛋白參與形成的復合物。分析可能是GST標簽本身分子量比較大,改變了apyrase的三維結(jié)構(gòu)導致無法形成復合物。
　　 于是將apyrase的編碼基因phoN2插入到更小的表達His標簽的PET32a載體中,構(gòu)建成功apryase-His融合表達載體,轉(zhuǎn)入BL21中,命名為BL-P

6、ET-apyrase。誘導表達后超聲破碎裂解細菌收集上清,發(fā)現(xiàn)在上清中有融合蛋白。然后利用鎳柱進行親和純化,純化得到apyrase-His融合蛋白。本實驗構(gòu)建的融合載體和純化的融合蛋白為以后的復合物的驗證奠定基礎。
　　 同時為了對apyrase與M90T-290復合物的功能進行初步探索,利用Red重組系統(tǒng)敲除M90T中apyrase的編碼基因phoN2。成功構(gòu)建了線性打靶片段。把線性打靶片段轉(zhuǎn)入含重組酶系統(tǒng)的PKOBEG感受態(tài)