慢病毒介導(dǎo)狨猴B2m基因沉默的初步研究.pdf

1、免疫缺陷動(dòng)物是指由于先天性遺傳缺陷或用人工方法造成免疫系統(tǒng)一種或多種成分缺陷的動(dòng)物，在研究人類(lèi)許多疾病機(jī)理、研發(fā)藥物、器官移植等工作中有重要的作用。構(gòu)建這類(lèi)疾病相關(guān)的基因修飾動(dòng)物模型是探究人類(lèi)各種免疫缺陷疾病分子機(jī)理和治療靶點(diǎn)的一種有效手段。近年來(lái)許多科研團(tuán)隊(duì)嘗試?yán)眯屡d的基因編輯技術(shù)構(gòu)建各種靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物疾病模型并取得一定進(jìn)展。慢病毒載體因其具有能介導(dǎo)外源基因在非分裂細(xì)胞中穩(wěn)定高效的表達(dá)、感染率高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

2、和基因治療研究的重要手段。將慢病毒載體特性與RNAi特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合，能在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)針對(duì)目標(biāo)基因的沉默，從而特異性降低其表達(dá)，并產(chǎn)生持續(xù)而穩(wěn)定的誘導(dǎo)靶基因沉默的效果。β2-微球蛋白是一個(gè)高度保守的低分子量蛋白質(zhì)，是主要組織相容性復(fù)合物MHCⅠ類(lèi)分子的輕鏈部分，功能是維持MHCⅠ類(lèi)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和輔助其向細(xì)胞表面表達(dá)。已有研究證實(shí)B2m基因缺陷會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)缺乏CD4-CD8+T細(xì)胞，造成免疫缺陷現(xiàn)象;現(xiàn)探究在靈長(zhǎng)類(lèi)

3、動(dòng)物體內(nèi)下調(diào)B2m基因的表達(dá)后，是否會(huì)與嚙齒類(lèi)動(dòng)物發(fā)生相似的分子機(jī)制。狨猴是小型非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，憑借其體型小、與人類(lèi)的親緣關(guān)系接近等優(yōu)點(diǎn)，適合建立成為腫瘤動(dòng)物模型，以便研究腫瘤發(fā)病機(jī)理及治療方案的研究。
　　目的：選擇與人類(lèi)已驗(yàn)證過(guò)的B2m基因shRNA靶點(diǎn)完全同源的狨猴B2m基因序列，在細(xì)胞水平篩選狨猴B2m基因的有效沉默靶點(diǎn)，并進(jìn)行驗(yàn)證。利用RNA干擾技術(shù)沉默狨猴B2m基因，分析狨猴B2m基因沉默后其外周血CD4和CD8細(xì)胞數(shù)

4、量上的變化，以期為構(gòu)建免疫缺陷狨猴模型奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)在細(xì)胞水平篩選狨猴B2m基因的有效沉默靶點(diǎn)，然后與狨猴B2m基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選到2條序列完全匹配，將它們合成shRNA干擾序列，并分別插入在介導(dǎo)RNA干擾的慢病毒載體上。將構(gòu)建的兩個(gè)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒在聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中B2m基因mRNA的水平。(2)分析狨猴

5、CD抗原(CD4+和CD8+)的一般表達(dá)水平:現(xiàn)有的動(dòng)物資源中共有20只未進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)的狨猴，每只抽取300ml后肢靜脈血用于流式統(tǒng)計(jì)狨猴CD4和CD8細(xì)胞的一般水平，為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(3)慢病毒介導(dǎo)狨猴B2m基因沉默:選擇干擾效率大于70％的靶點(diǎn)包裝成介導(dǎo)RNAi的慢病毒，將介導(dǎo)B2m基因沉默的慢病毒和空載對(duì)照病毒通過(guò)狨猴后肢靜脈分別注射到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物體內(nèi)，每周取500ml后肢靜脈血進(jìn)行流式分析和血常規(guī)檢測(cè)，分析狨猴

6、CD4和CD8細(xì)胞和CD4/CD8的比值變化。
　　結(jié)果：(1)通過(guò)與人源B2m基因shRNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出2個(gè)與狨猴完全同源的B2m沉默靶位點(diǎn)，分別位于狨猴B2m mRNA的405bp～425bp，780bp～800bp。結(jié)果為兩個(gè)沉默靶點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄水平的沉默效率分別是（46.54±7.91）％(p＜0.05)和（83.22±4.37）％(p＜0.0001)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中第二個(gè)靶點(diǎn)沉默效率大于70％，適合進(jìn)行后續(xù)的動(dòng)物

7、水平實(shí)驗(yàn)。(2)將抽取的20份狨猴靜脈血樣進(jìn)行流式分析，得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以x±s表示:CD4％的值為(32.9±7.3)％;CD8％的值為(24.9±6.6)％。CD4/CD8的值為(1.47±0.45)。(3)將每周抽取的血樣進(jìn)行流式分析，結(jié)果顯示與對(duì)照組狨猴相比，實(shí)驗(yàn)組狨猴血樣中，CD4、CD8細(xì)胞數(shù)量以及CD4/CD8比值明顯下降，表明慢病毒介導(dǎo)的對(duì)狨猴B2m基因進(jìn)行RNAi后，對(duì)狨猴免疫水平有影響。
　　結(jié)論：本