CyPA、褪黑素在高血壓左室肥厚中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 褪黑素通過CyPA/CD147信號(hào)通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大
　　目的：
　　1.本研究通過建立血管緊張素Ⅱ或親環(huán)素A誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大模型，觀察褪黑素對(duì)心肌細(xì)胞表面積、[3H]-亮氨酸的摻入量以及心肌細(xì)胞肥大特征性分子表達(dá)等方面的影響。
　　2.明確CyPA/CD147信號(hào)通路在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中的作用。
　　3.探討褪黑素保護(hù)

2、心肌肥厚的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　復(fù)蘇并培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞至理想細(xì)胞密度。①以一定濃度的血管緊張素Ⅱ刺激H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生肥大反應(yīng)，加入不同濃度的褪黑素預(yù)處理細(xì)胞，觀察褪黑素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。②應(yīng)用環(huán)孢素A預(yù)處理H9C2細(xì)胞，觀察抑制親環(huán)素A在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大中的保護(hù)作用。③親環(huán)素A刺激H9C2細(xì)胞發(fā)生肥大，以不同濃度的褪黑素預(yù)處理

3、細(xì)胞，觀察褪黑素對(duì)親環(huán)素A誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2.[3H]-亮氨酸摻入試驗(yàn):
　　用于測定H9C2心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率。
　　3.細(xì)胞免疫熒光法:
　　測定α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、CyPA及CD147的蛋白水平以及細(xì)胞內(nèi)的定位，并用軟件分析測量心肌細(xì)胞表面積。
　　4.蛋白印跡(Western Blot):
　　收集各組細(xì)胞提取蛋

4、白，分別檢測α-SMA、CyPA、CD147、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOx2)等蛋白表達(dá)水平。
　　5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR):
　　用于在基因水平檢測各組細(xì)胞中α-SMA、β心肌肌球蛋白重鏈(β

5、-myosin heavy chain，β-MHC)、心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP) mRNA水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.褪黑素預(yù)處理抑制了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大
　　與對(duì)照組相比，100nmol/L AngⅡ刺激H9C2細(xì)胞24小時(shí)后，[3H]-亮氨酸的摻入量增加，H9C2細(xì)胞表面積增大，心肌細(xì)胞肥大特征性分子mRNA表達(dá)量增加，提示H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生了

6、肥大反應(yīng);且Western Blot、細(xì)胞免疫熒光法以及PCR等檢測方法均顯示肥厚性蛋白α-SMA的表達(dá)水平明顯升高，兩者之間有顯著性差異(p＜0.05)。而給予褪黑素預(yù)處理后減輕了上述變化，且呈劑量依賴性(p＜0.05)，褪黑素濃度達(dá)500umol/1時(shí)作用最強(qiáng)。
　　2.褪黑素可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生氧化反應(yīng)
　　與對(duì)照組比較，DCFH-DA法測定的Ang Ⅱ組細(xì)胞ROS水平，以及Western Bl

7、ot法檢測顯示的氧化性蛋白NOx2的表達(dá)水平均明顯升高(p＜0.05);而經(jīng)過不同劑量褪黑素的預(yù)處理可明顯減少上述變化，同樣呈劑量依賴性(p＜0.05)。
　　3.CyPA/CD147信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大過程
　　與對(duì)照組相比，100nmol/L AngⅡ刺激H9C2細(xì)胞24小時(shí)后，Western Blot和細(xì)胞免疫熒光法檢測均顯示CyPA及其下游因子CD147的表達(dá)水平均明顯升高(p＜0

8、.05);而CyPA抑制劑CsA預(yù)處理后CyPA、CD147的表達(dá)水平明顯減低(p＜0.05)。同時(shí)，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CsA對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的增值無明顯影響(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.褪黑素能顯著抑制血管緊張素Ⅱ或CyPA誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生肥大。
　　2.褪黑素通過抗氧化作用抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大，其作用機(jī)制至少部分是通過CyPA/CD147信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　第

9、二部分 血清CyPA、褪黑素水平與高血壓左室肥厚的相關(guān)性研究
　　目的：
　　1.研究高血壓左室肥厚患者血清褪黑素、CyPA表達(dá)水平。
　　2.探討血清褪黑素、CyPA與高血壓左室肥厚的相關(guān)性，并統(tǒng)計(jì)分析高血壓左室肥厚的其他獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　3.進(jìn)一步探討高血壓左室肥厚患者中褪黑素、CyPA兩者之間的相關(guān)性。
　　方法：
　　收集2015年10月至2016年10月期間就診山東省胸科醫(yī)院心內(nèi)科門診及健

10、康查體中心的原發(fā)性高血壓患者135例，據(jù)心臟彩超檢查計(jì)算出的左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)結(jié)果分為高血壓左室肥厚組[LVH(+)]70例及高血壓非左室肥厚組[LVH（-）] 65例。詳細(xì)采集所有實(shí)驗(yàn)者病史，并測量血壓(blood pressure)、心率(heart rate)、身高(height)、體重（weight）等;測定血清中CyPA、melatonin、ET-1、CRP、IL-

11、6、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase 2,NOx2)、NT-proBNP、肌鈣蛋白Ⅰ（troponin Ⅰ，TnⅠ）等因子的水平。所有入選者均進(jìn)行高頻超聲檢查測定左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventr

12、icular internal diameter at end-systole，LVIDs)、室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，EF)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)。左室心肌重量(left ventricular m

13、ass，LVM)、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)和左室相對(duì)室壁厚度(relative wall thickness，RWT)均分別采用公式計(jì)算。
　　所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)描述，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。用t檢驗(yàn)和方差分析比較高血壓左室肥厚組[LVH(+)]和高血壓非左室肥厚組[LVH(-)]間計(jì)量資料，x2檢驗(yàn)比較兩組間

14、計(jì)數(shù)資料。采用Pearson和Partial相關(guān)性分析方法進(jìn)行變量之間的相關(guān)分析，得出與高血壓左室肥厚明顯相關(guān)的變量;通過多元線性回歸統(tǒng)計(jì)分析LVH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為p＜0.05。
　　結(jié)果：
　　1.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH（-）]基本資料和一般血液檢查資料比較
　　LVH(+)組與LVH(-)組相比，年齡(age)、糖尿病病史(diabetes)、吸煙史(sm

15、oking index)、飲酒史(drinking index)、各種主要降壓藥物使用情況、舒張壓(DBP)、白細(xì)胞(WBC)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)、肌酐(Scr)、尿酸(UA)、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、AST（門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等因素?zé)o顯著性差異(p＞0.05)。兩組在女性(female)患病數(shù)、冠心病

16、(coronary artery disease，CAD)患病數(shù)、收縮壓(SBP)水平、高血壓病程(hypertension)、體重指數(shù)(body mass index，BMI)等均有明顯差異(p＜0.05)，LVH(+)組高于LVH(-)組。
　　2.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH（-）]心臟超聲指標(biāo)比較
　　與LVH(-)組相比，LVH(+)組的LVM、LVMI、LVIDd、IVST、LVP

17、WT、RWT明顯升高，有顯著性差異(p＜0.001);但兩組間LVEF、LVIDs之間無顯著性差異(p＞0.05)。
　　3.高血壓左室肥厚組[LVH(+)]、高血壓非左室肥厚組[LVH（-）]血清CyPA、melatonin、ET-1、CRP、IL-6、NOx2、cTnI、NT-proBNP等水平的比較
　　與LVH(-)組相比，LVH(+)組血清中CyPA、ET-1、IL-6水平均有升高，血清NOx2、melatonin