IL-17A對骨折急性期修復與愈合過程的影響及其機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  利用臨床標本、動物模型以及體外實驗探討內源性和外源性白細胞介素-17A(Interleukin-17A, IL-17A,也稱作IL-17)對骨折急性期愈合過程的影響及其相關機制,旨在為治療骨折、縮短骨折愈合時間、探索治療骨不連疾病提供實驗依據和新思路。
  方法:
  1.采集單純長骨骨干骨折患者受傷后不同時間點外周血,以及健康人群志愿者外周血。
  2.采用流式細胞術對骨折患者不同時間點及健康人外周

2、血單核細胞中輔助T細胞-17(T-help-17, Th17)的比例進行分析,并應用ELISA方法檢測受試者血清中IL-17A水平。
  3.對臨床納入實驗的常見的單純長骨干骨折患者行骨折切開復位內固定手術,術中提取骨折周圍部分軟組織標本,免疫組化檢測骨折周圍部分軟組織標本IL-17A的表達水平。
  4.利用C57 BL/6遺傳背景的IL-17A-/-小鼠(Knock Out, KO)和野生型(Wild Type, WT)

3、為研究對象,建立野生型和IL-17A-/-小鼠股骨干骨折動物模型。應用X-ray和Micro-CT技術于模型建立后的第3,7,14,21,28天五個時間點,檢測實驗對象骨折愈合程度。
  5.采用免疫組化技術檢測小鼠股骨干骨折動物模型骨折斷端周圍組織中IL-17A的表達情況;分別應用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應技術(qRT-PCR)和免疫蛋白印跡技術(Western blot, WB)檢測骨折斷端周圍組織中成骨相關基因Runx

4、2、Col1、Col2、SOX9、Osterix的mRNA表達以及β-catenin、SOX9、Col2、Osterix的蛋白表達水平。
  6.分別從C57 BL/6WT和IL-17AKO新生小鼠的顱骨制備原代成骨細胞,分別應用qRT-PCR和WB技術檢測上述細胞成骨相關基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白水平;分別以rhIL-17A、rhIL-17A+DKK1(β-catenin抑

5、制劑)、rhIL-17A+DAPT(Notch抑制劑)處理上述細胞,培養(yǎng)3、7天,以qRT-PCR和WB技術檢測成骨相關基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白表達水平。
  結果:
  1.本研究共納入診斷為單純長骨干骨折患者22例,經篩選配對,共入選志愿者22例?;颊呓M與健康對照組之間年齡、性別等一般資料均未見統計學差異。
  2.被納入的單純長骨干骨折患者在受傷后第1天,

6、和對照組相比,外周血中Th17細胞比例稍高(P<0.05);在觀察點內固定手術后第3天,和對照組相比外周血中Th17細胞比例明顯升高(P<0.01),與受傷后第1天相比也明顯升高(P<0.01);在術后第7天與術后第1天相比,Th17細胞比例降低(P<0.05),與對照組相比,Th17細胞比例仍然稍高,但不存在統計學意義(P>0.05)。
  3.血清IL-17A含量使用 ELISA檢測法結果顯示,受傷后第1天,血清 IL-17A

7、含量較對照組基線開始升高,在術后第3天明顯升高,與骨折后第1天對比存在統計學意義(P<0.01),術后第7天較骨折后第1天也有所升高,但不存在統計學意義。
  4.X-ray結果顯示:骨折模型建模后第3天,KO及WT實驗模型小鼠的骨折斷端對位對線均較好,骨折斷端兩側無明顯扭轉、位移,錯位程度在正常范圍;骨折線都較為清晰,骨折斷端周圍尚無新生骨痂形成;這兩種實驗模型小鼠皆處于血腫機化期。骨折模型建模后第7天,KO及WT實驗模型小鼠的

8、模型骨折斷端對位對線較好,骨折斷端兩側無明顯扭轉、位移;兩種實驗模型小鼠骨折斷端都較3天更為清晰,骨折斷端周圍尚無新生骨痂形成。骨折模型建模后第14天,KO及WT實驗模型小鼠骨折斷端周圍出現骨痂影,骨折線開始模糊。骨折模型建模后第21天,KO及WT實驗模型小鼠骨折斷端周圍出現大量骨痂影,成紡錘型影像影,WT實驗小鼠骨折線已經消失。骨折模型建模后第28天, KO及WT實驗模型小鼠股骨折斷端處骨痂較前時相縮小,WT實驗組小鼠骨折斷端處改建已

9、經基本完成。
  5. Micro-CT發(fā)現在建模3天后骨折斷端可見骨折斷端對合良好,KO及WT實驗模型小鼠股骨標本設定興趣區(qū)BV/TV值無顯著差異;而在建模后7、14、21天發(fā)現WT模型組較KO模型組骨折斷端周圍較早出現新生骨痂,形態(tài)呈坡形隆起,骨痂內有新生骨組織,KO及WT兩組實驗模型小鼠的股骨標本設定興趣區(qū)BV/TV值存在明確顯著性差異(P<0.05),KO模型組骨折斷端骨量較WT模型組減低。建模后28天,KO及WT實驗模型

10、小鼠股骨骨折斷端均已愈合完成改建,KO及WT實驗模型小鼠股骨標本設定興趣區(qū)BV/TV值無顯著差異(P>0.05)。
  6.采用免疫組織化學技術分析小鼠骨折模型股骨組織標本中IL-17A的表達:WT模型組小鼠股骨組織標本在建模后3、7、14天骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均有IL-17A的表達,建模后3、7天表達強度較高; KO模型組小鼠股骨組織標本在建模后3、7、14天骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均無IL-17A的表達。在模型建立后2

11、1、28天,KO及WT實驗模型小鼠股骨組織標本骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均未探測到IL-17A的表達。
  7.實時熒光定量RT-PCR分析結果:在建模后第3、7、14天,WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織標本中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix和Runx2的mRNA的轉錄水平均顯著高于KO模型組組織標本(P<0.05)。在建模后第21天,WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織

12、標本中Col1、Col2及β-catenin的mRNA的轉錄水平依然顯著高于KO模型組組織標本(P<0.05),然而SOX9、Osterix和Runx2的mRNA的轉錄水平在兩組之間已無顯著性差異(P>0.05)。在建模后第28天,WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織標本中Col2與β-catenin的mRNA的轉錄水平持續(xù)顯著高于KO模型組組織標本,兩組間扔存在顯著性差異(P<0.05),Col1、SOX9、Osterix

13、和Runx2的mRNA的轉錄水平在兩組之間已無顯著性差異(P>0.05)。
  8.兩組骨折模型造模后第0天,目標蛋白β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix在兩組骨折斷端處周圍軟組織標本中表達并未見顯著性差異(P>0.05);骨折模型造模后第3、7、14、21天,β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix表達均有顯著差異(P<0.05),KO組小鼠骨折斷端處周圍軟組織標本表達量明顯低

14、于WT組;但是于骨折模型造模后第14天,SOX9蛋白表達未見明顯差異,骨折模型造模后第21天,Col2蛋白表達水平未見顯著性差異;骨折模型造模后第28天,Col2、SOX9蛋白表達水平仍有顯著性差異,β-catenin、Osterix蛋白表達水平未見顯著性差異(P>0.05)。
  9. WT小鼠原代成骨細胞中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的轉錄水平均高于KO小鼠原代成骨細胞;靶分子β-ca

15、tenin在外源性的IL-17A存在的情況下mRNA的轉錄水平顯著高于KO組的轉錄水平,β-catenin抑制劑DKK1可以明顯抑制各組中β-catenin的轉錄表達水平,同時降低了成骨相關 SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的轉錄水平;在連續(xù)培養(yǎng)3-7天,我們發(fā)現DKK1可以明顯抑制各組中β-catenin的轉錄表達水平,并且使成骨細胞各成骨相關基因轉錄水平峰值后移;IL-17A對成骨細胞的調節(jié)作用的機制可能依賴Wnt

16、信號通路。并且,在對外源性IL-17A刺激的響應上,IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨細胞成骨相關基因的表達,與WT小鼠相比更加后滯,這說明IL-17A-/-基因敲除小鼠對外源性IL-17A的刺激響應不敏感。
  10. WT小鼠原代成骨細胞中Notch、Hes1、Rjbpκ的轉錄水平均低于KO小鼠原代成骨細胞,但Col2、Osterix的轉錄水平均高于KO小鼠原代成骨細胞;在外源性的IL-17A存在的情況下,WT組靶分子Not

17、ch、Rjbpκ的mRNA轉錄水平顯著低于KO組;Notch抑制劑DAPT明顯下調了各組中Notch、Rjbpκ的轉錄表達水平,同時上調了成骨相關Col2、Osterix的轉錄水平;IL-17A對Notch信號轉導通路也存在調控作用;IL-17A對KO及WT小鼠原代成骨細胞中Notch、Rjbpκ蛋白水平的表達有抑制作用,在加入DAPT后,Notch、Rjbpκ蛋白水平的表達受抑制,成骨蛋白Col2、Osterix的表達增強,這種較強的

18、作用持續(xù)到連續(xù)培養(yǎng)的第5天,而后呈現下降的趨勢,這種作用于7天后趨于平穩(wěn);并且,與WT小鼠成骨細胞相比,IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨細胞對于外源性IL-17A的刺激的信號調控存在顯著性差異;WT小鼠成骨細胞對外源性IL-17A的刺激更加敏感。
  結論:
  通過體外實驗、動物實驗和臨床標本分析,本研究結果提示:IL-17A可參與骨折愈合的整個過程,促進骨折斷端周圍組織中β-catenin、SOX9、Col1、Col

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