扶正消瘤顆?？筂CF-7耐藥細胞體外增殖及機理研究.pdf

1、目的：乳腺癌為嚴重危害全球女性健康的惡性腫瘤,全球每年約有100萬婦女患乳腺癌,約有40萬人死于該病,其發(fā)病率逐年上升,且年齡趨于年輕化。發(fā)達國家為乳腺癌高發(fā)區(qū),我國雖屬乳腺癌低發(fā)地區(qū),但發(fā)病率仍居女性惡性腫瘤首位。21世紀,我國乳腺癌發(fā)病率城市高于農(nóng)村,經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)的發(fā)病率更高。手術、放療、化療、內(nèi)分泌、生物治療及中醫(yī)中藥治療為當今乳腺癌的主要治療方法,化療在其中占重要地位,而乳腺癌細胞對化療藥物耐藥已為乳腺癌治療不能取得治愈性療效的

2、最主要原因。近10年來,許多學者致力于乳腺癌的多藥耐藥性研究,發(fā)現(xiàn)乳腺癌多藥耐藥基因(MDR1)及其編碼的糖蛋白(P—gp)是引起乳腺癌耐藥的主要原因。
　　 因此,尋找耐藥逆轉劑、增強化療療效是腫瘤化療急需解決的重大課題。大量逆轉腫瘤耐藥的研究發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、免疫調(diào)節(jié)劑、鈣調(diào)蛋白拮抗劑等藥具有逆轉耐藥活性,但因療效欠佳、作用靶點單一、毒副作用大等缺點難以應用于臨床。中藥復方因療效確切、多靶點、毒副作用小等優(yōu)點,具有很大的研究

3、價值。從中藥復方中尋找安全有效的耐藥逆轉劑逐漸成為當今研究熱點。
　　 中藥復方體外藥理研究的發(fā)展,復方中藥含藥血清理論的提出為深入研究復方中藥抗腫瘤機制開辟了新的出路。血清藥理學是指將中藥或中藥復方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液、分離血清,用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種半體內(nèi)實驗方法。該方法主要有兩個特點:一是克服了用中藥制劑直接進行體外實驗時,中藥制劑本身的理化性質對實驗的干擾；二是實驗結果與在體實驗有較好的一

4、致性,不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用,而且還能反映可能藥物誘導機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用,為從細胞分子水平研究中藥藥理學作用提供了新的手段。
　　 中醫(yī)學認為,乳腺癌屬“乳巖”范疇,多表現(xiàn)為虛實夾雜證,表現(xiàn)為氣、血、陰、陽不足,以及痰濁、瘀血、熱毒夾雜作用的結果。惡性腫瘤本為正氣虛損、陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)所致,手術、放療、化療進一步損耗氣血,正氣受創(chuàng)。遂治療上宜扶正培本,去除邪毒,改善機體內(nèi)環(huán)境,減輕放化療

5、毒副反應及手術對機體免疫功能的抑制,調(diào)補先后天之本,調(diào)動和增強機體自身抗癌能力。大量研究證實許多中藥及復方具抗腫瘤活性,不僅能提高機體免疫功能,還能抑制癌細胞的分裂,改善癥狀,提高患者的生存質量,延長生存期。
　　 針對乳腺癌本虛標實的病機,導師結合多年臨床經(jīng)驗,擬制中藥復方扶正消瘤顆粒,功以益氣養(yǎng)陰扶正,解毒散結、祛瘀化痰消瘤,對乳腺癌術后放化療增效、減輕并發(fā)癥、增強免疫力,延緩腫瘤轉移具有較好的療效。方中以西洋參、靈芝、百合

6、、黃芪益氣養(yǎng)陰,清熱生津；增強患者脾胃運化功能,補益中氣；薏苡仁、豬苓、法半夏、陳皮化痰祛濕濁,助脾胃運化；三棱、莪術活血祛瘀,使瘀血去則新血生,即祛瘀生新之功；半枝蓮、白花蛇舌草、山慈菇、黃藥子解毒散結消瘤,清除余毒；諸藥共用,益氣健脾養(yǎng)陰,扶正固本,化痰祛瘀,解毒消瘤而達到增強免疫、減毒增效的作用。
　　 本實驗通過研究扶正消瘤顆粒含藥血清對乳腺癌細胞MCF-7耐藥細胞體外增殖及機理的研究,為深入研究扶正消瘤顆粒臨床療效的作

7、用機制奠定基礎。
　　 方法：
　　 1、采用濃度梯度試驗誘導法,應用聯(lián)合化療藥物(紫杉醇和表柔比星的最高血藥濃度,PPC)誘導耐藥MCF-7/ADM多藥耐藥,并研究MCF-7多耐藥細胞的基本性狀、細胞生長曲線及MCF-7對聯(lián)合化療藥物的最大耐藥濃度；
　　 2、采用動物實驗常用的等效劑量折算系數(shù)公式,折算大鼠每日給藥量。將扶正消瘤顆粒劑用溫水配制成三種不同的倍數(shù)濃度即1倍量、2倍量、3倍量,對照組予生理鹽水,連

8、續(xù)灌胃3天,最后1次灌胃結束后60～120分鐘,行下腔靜脈采血制備血清；
　　 3、MTT法檢測。設空白組(SFM+耐藥細胞+0.35PPC,Blnak)、1倍劑量組(SFM+耐藥細胞+1FZXL+0.35PPC,1FZXL)、2倍劑量組(SFM+耐藥細胞+2FZXL+0.35PPC,2FZXL)、3倍劑量組(SFM+耐藥細胞+3FZXL+0.35PPC,3FZXL)；四唑鹽比色法(MTT法)測定扶正消瘤顆粒含藥血清抗MCF-7

9、多藥耐藥細胞的體外增殖作用；各組分別于培養(yǎng)3、4、5、6、7天五個時間點行MTT法檢測細胞吸光值(OD),比較各組間的差異；
　　 4、用RT—PCR法分別測定不同含藥血清作用后耐藥細胞的多藥耐藥基因MDR1的表達陽性率；設陰性對照MCF-7/S,陽性對照MCF-7/ADM耐藥細胞及實驗組Blank、1FZXL、2FZXL、3FZXL連續(xù)培養(yǎng)7天,采用Trizol試劑提取各組總RNA,PCR反應條件為94℃預變性2min,進入循

10、環(huán)94℃30s,55℃30s,72℃60s,共35個循環(huán),最后72℃延伸10min,2％瓊脂糖凝膠電泳分離,溴化乙錠染色,紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描,并用Gelbase電腦軟件進行光密度分析,計算MDR1mRNA的相對含量。
　　 5、用WESTERN(蛋白印記)法測定敏感細胞和不同含藥血清作用后耐藥細胞P-GP的陽性表達。取實驗培養(yǎng)后7d的細胞(每組細胞約1×107個),加入細胞裂解液,冰浴上超聲粉碎；取出上清液(蛋白),分光光度計

11、下測量樣品的純度；取蛋白樣品各100ug上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳進行蛋白轉膜,加入5％脫脂奶粉封阻90分鐘,加入一抗P-gp(1:160)4℃過夜,TTBS洗膜15min×3次,加二抗37℃40分鐘,TTBS洗膜15分鐘×3次,加辣根過氧化物酶37℃40分鐘,TTBS洗膜15分鐘×3次,DAB顯色。實驗重復3次,UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,比較各條帶的吸光度值。
　　 統(tǒng)計方法：
　　 1、統(tǒng)計描述:計量資料數(shù)據(jù)統(tǒng)計

12、用均數(shù)±標準差((x)±s)；
　　 2、統(tǒng)計推斷:計量資料的比較用one-way ANOVA,多組率的比較用KIndependent Sample Test檢驗；
　　 3、采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,P<0.05為統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異。
　　 結果：
　　 1、乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM對聯(lián)合化療藥的耐藥作用具有一定耐受作用；x2=14.965,V=5,P=0.011,P<0.

13、05,各組不同PPC對MCF-7/ADM細胞抑制率有顯著差異,據(jù)平均秩次進一步推斷,1.0ppc抑制效果最好,0.5ppc效果次之,0.1ppc抑制效果最差。從0.1PPC～0.35PPC4組比較中,可知x2=6.846,v=3,P=0.077,4組間細胞抑制率分布無顯著性差異,即認為聯(lián)合化療藥物在0.1PPC～0.35PPC濃度范圍內(nèi)對MCF-7/ADM耐藥細胞增殖影響無顯著差異；說明MCF-7/ADM耐藥細胞對聯(lián)合化療藥物濃度(PP

14、C)的最大耐藥濃度為0.35PPC。
　　 2、較大劑量扶正消瘤顆粒含藥血清有明顯的抑制MCF-7耐藥細胞增殖作用；比較各組細胞增殖抑制率可知,NFZXL、1FZXL、2FZXL、3FZXL四組細胞抑制率有顯著差異(x2=16.129,v=3,P=0.001),且2FZXL組效果最好,3FZXL組效果次之,1FZXL組再次之,NFZXL最差(平均秩次依次為15.9、15.10、8.0、3.0)；兩兩比較,2FZXL與3FZXL兩

15、組抑制率差異無顯著性(U統(tǒng)計量為10.50,W為25.50,Z=-0.419,P=0.690)。說明扶正消瘤顆粒加倍量對MCF-7耐藥細胞增殖具更明顯抑制作用,即可明顯增強MCF-7耐藥細胞對聯(lián)合化療藥物的敏感性。
　　 3、扶正消瘤顆粒含藥血清可通過下調(diào)MCF-7耐藥細胞的多耐藥基因MDR1的轉錄及P—gp蛋白的表達抑制細胞增殖作用。RT—PCR檢測結果顯示,2FZXL(1.05±0.01)與3FZXL(1.06±0.02)兩

16、組與MCF-7/ADM(2.08±0.03)細胞組相比,P<0.05,可信區(qū)間分別為(0.982,1.078)和(0.972,1.068),差異有顯著意義,可認為2FZXL和3FZXL兩組多藥耐藥基因mRNA轉錄水平較MCF-7/ADM組有明顯下降；NFZXL(2.01±0.04)組MCF-7/ADM相比,P=0.114,兩組差異無顯著意義,說明2FZXL和3FZXL兩組含藥血清有下調(diào)MDR1 mRNA轉錄的作用；在P-gp糖蛋白的表達

17、水平比較中,2FZXL和3FZXL兩組的表達水平均較MCF-7/ADM組有明顯下降,P<0.05,可信區(qū)間分別為(4.51,13.95)和(4.04,13.48)。認為兩組均可下調(diào)乳腺癌MCF-7耐藥細胞P-gp糖蛋白的表達；說明2FZXL及3FZXL組含藥血清均可通過下調(diào)MDR1 mRNA轉錄及P-gp糖蛋白的表達而達到抑制耐藥細胞增殖。
　　 結論：
　　 1、乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM對紫杉醇和表阿霉素聯(lián)合化