t-AUCB調(diào)控Hsp27相關(guān)信號(hào)通路并誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生率最高的惡性腫瘤，因血腦屏障的存在，以及膠質(zhì)瘤本身存在多種耐藥，其化療效果欠佳。既往研究表明，抑制熱休克蛋白27（Hsp27），能使可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB明顯發(fā)揮誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究以Hsp27為切入點(diǎn)，深入探討t-AUCB誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，并闡明Hsp27激活導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷及治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。Notch信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)與多種腫

2、瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等存在密切關(guān)系，抑制Notch信號(hào)通路的γ-分泌酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞肌動(dòng)蛋白張力纖維形成過(guò)程中可以阻斷p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路活化，據(jù)此本文首先釆用γ-分泌酶抑制劑DAPT在p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號(hào)通路上游對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行對(duì)t-AUCB的敏感性研究；再通過(guò)抑制AKT，在p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號(hào)通路下游對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行t-AUCB的

3、敏感性研究；最后在膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中用免疫組織化學(xué)染色方法，發(fā)現(xiàn)Hsp27在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中明顯高表達(dá)，對(duì)其與臨床預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析。
　　第一部分抑制Hsp27活化對(duì)t-AUCB誘導(dǎo)凋亡的增強(qiáng)作用
　　目的旨在探索γ-分泌酶抑制劑DAPT是否能夠提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)t-AUCB促凋亡作用的敏感性。
　　方法實(shí)驗(yàn)分組：DMSO對(duì)照組、2μM DAPT處理組、200μM的t-AUCB處理組、2μM的DAPT預(yù)處理4小時(shí)后聯(lián)用

4、200μM的t-AUCB組。采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法，檢測(cè)DAPT及t-AUCB對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞增殖能力的作用，并以流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞凋亡程度，Western Blot蛋白印跡法檢測(cè)p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號(hào)通路中p38MAPK,MAPKAPK2和Hsp27的磷酸化水平及Notch-1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。所有的數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果 DAPT在較低濃度（2μM）時(shí)就

5、能顯著增強(qiáng)t-AUCB介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制作用，抑制p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路活化。DAPT及t-AUCB聯(lián)合用藥能夠使U251和U87的凋亡率分別從4.5±1.8％和5.1±1.5%增加至21.9±3.6%和20.8±2.1%(P<0.01)。免疫印跡法檢測(cè)顯示，t-AUCB處理后p38MAPK,MAPKAPK2和Hsp27的磷酸化水平均明顯增加，而在DAPT聯(lián)合應(yīng)用t-AUCB的細(xì)胞中，磷酸化水平顯著降低，DAP

6、T可顯著抑制Hsp27磷酸化。
　　結(jié)論 DAPT通過(guò)抑制p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路的活化，抑制了t-AUCB誘導(dǎo)的Hsp27通路的活化，發(fā)揮了t-AUCB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可增加對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷力，靶向阻斷Hsp27信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分抑制由Hsp27導(dǎo)致的AKT活化能增強(qiáng)t-AUCB的誘導(dǎo)凋亡作用
　　目的驗(yàn)證t-AUCB處理細(xì)胞后導(dǎo)致的Hsp

7、27磷酸化是否引起AKT的磷酸化，抑制AKT磷酸化水平能否促進(jìn)t-AUCB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并評(píng)估同時(shí)抑制Hsp27和AKT的磷酸化對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。
　　方法采用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和LN443，用藥分組為DMSO對(duì)照組、t-AUCB組、Hsp27抑制劑KRIBB3組、AKT抑制劑IV組、KRIBB3聯(lián)合應(yīng)用t-AUCB組、IV聯(lián)合應(yīng)用t-AUCB組，以及KRIBB3與IV、t-AUCB聯(lián)合應(yīng)用組，細(xì)胞增殖

8、能力通過(guò)CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；流式細(xì)胞技術(shù)分析不同組別細(xì)胞凋亡率的差異；western blot法檢測(cè)AKT磷酸化水平；RNA干擾技術(shù)下調(diào)Hsp27的基因表達(dá)，以判斷AKT磷酸化水平是否依賴于Hsp27的磷酸化激活。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果與對(duì)照組相比，Hsp27與AKT在U251中的磷酸化水平在200μM t-AUCB作用48小時(shí)后明顯升高，然而10μM KRIBB3預(yù)處理1小時(shí)后聯(lián)合應(yīng)用200μM

9、 t-AUCB作用并沒(méi)有明顯的促進(jìn) Hsp27和 AKT的磷酸化。LN443細(xì)胞中200μM t-AUCB作用后，原先的Hsp27與AKT的磷酸化水平均有所增加，但是無(wú)論是否使用t-AUCB處理，Hsp27的siRNA均能夠顯著降低Hsp27磷酸化水平。單用200μM t-AUCB，細(xì)胞凋亡不明顯，U251凋亡率10.5±1.5%，LN443凋亡率9.7±1.2%；單獨(dú)使用0.5μM AKT抑制劑IV作用也沒(méi)有顯示出明顯的細(xì)胞凋亡率改變

10、，U251凋亡率為12.1±1.3%，LN443凋亡率為11.8±1.2%；而0.5μM AKT抑制劑IV預(yù)處理1小時(shí)后聯(lián)合應(yīng)用200μM t-AUCB作用72小時(shí)后，U251凋亡率增至24.5±2.1%，LN443凋亡率增至20.1±1.4%。200μM t-AUCB對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，而KRIBB3、AKT抑制劑IV與t-AUCB聯(lián)合作用下U251和LN443細(xì)胞增殖受到更強(qiáng)的抑制，Akt抑制劑IV和KRIBB3聯(lián)合預(yù)處理組與單獨(dú)

11、預(yù)處理組相比，t-AUCB的細(xì)胞增殖抑制作用被明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論磷酸化Hsp27介導(dǎo)的AKT磷酸化能夠引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)t-AUCB誘導(dǎo)凋亡的抵抗。抑制Hsp27和/或AKT的磷酸化或活性，能顯著減弱細(xì)胞對(duì)t-AUCB的抵抗，從而促進(jìn)t-AUCB對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　第三部分 Hsp27、MGMT和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義
　　目的通過(guò)檢測(cè)Hsp27、MGMT和Oct4在膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中

12、的表達(dá)，分析臨床病理級(jí)別與三者之間的相關(guān)性，在已知 MGMT臨床應(yīng)用的前提下，探討 Hsp27和Oct4在膠質(zhì)瘤臨床治療中可能的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法1、40例星形細(xì)胞瘤，其中WHOⅡ級(jí)12例，WHOⅢ級(jí)12例，WHOⅣ級(jí)16例。2、SP免疫組織化學(xué)染色法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，半定量法評(píng)估免疫組化結(jié)果。3、采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)或FISH精確檢驗(yàn)法分析Hsp27、MGMT以及Oct4三種分子標(biāo)志物在不同級(jí)別腫瘤

13、中的表達(dá)差異及其與患者性別、復(fù)發(fā)、放化療的臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)；Spearman等級(jí)相關(guān)分析用于研究三種指標(biāo)在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果 Hsp27、MGMT和Oct4在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ/Ⅳ級(jí)）表達(dá)率分別為85.7%、53.6%和75%，低級(jí)別星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）表達(dá)率分別為16.7%、16.7%和25%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，高級(jí)別星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ/Ⅳ級(jí)）與低級(jí)別星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級(jí)）相比，其 Hsp2

14、7、MGMT以及 Oct4的表達(dá)率明顯增高；Hsp27的表達(dá)與患者性別、是否行放化療無(wú)關(guān)，但是與腫瘤復(fù)發(fā)與否顯著相關(guān)；MGMT的表達(dá)與患者性別、腫瘤復(fù)發(fā)、放化療均無(wú)關(guān)；Oct4的表達(dá)與患者性別無(wú)關(guān)，但與腫瘤復(fù)發(fā)、放化療顯著相關(guān)；星形細(xì)胞瘤中Hsp27與Oct4的表達(dá)有明顯正相關(guān)。
　　結(jié)論 Hsp27與Oct4均在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展或者其耐受抗腫瘤藥物過(guò)程中存在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究?jī)?/p>