一種基于構(gòu)件重組原理構(gòu)建基因文庫方法的研究.pdf

1、酶的定向進(jìn)化能夠取得成功的兩個(gè)關(guān)鍵是建立多樣性突變庫和有高效的篩選系統(tǒng)。本文利用agaB基因在表達(dá)時(shí)可以水解瓊脂糖的特性構(gòu)建了一種高效率的組成型表達(dá)篩選載體:基于構(gòu)建重組的原理利用共用接頭互補(bǔ)重聚構(gòu)建了一個(gè)大容量的基因文庫。
　　 1.利用穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率高的pBluescriptⅡ KS(+)克隆載體質(zhì)粒作為構(gòu)建載體的母核,插入agaB啟動(dòng)子構(gòu)建組成型表達(dá)載體,并利用pET-24a(+)上的酶切位點(diǎn)對(duì)表達(dá)載體上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行改

2、造,再插入agaB基因構(gòu)建組成型篩選載體。由于agaB基因表達(dá)時(shí)能在固體LB培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈,雙酶切后的載體連接目的片段在固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行表達(dá)時(shí),有水解圈的即為雙酶切不完全的假陽性克隆,而沒有水解圈的單克隆為插入了目的基因的陽性克隆。利用卡那霉素抗性基因檢驗(yàn)篩選載體的效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,篩選效率達(dá)到90％以上,比傳統(tǒng)載體篩選效率高很多,且不需要藍(lán)白斑篩選,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,減少了實(shí)驗(yàn)成本。
　　 2.大容量基因文庫的構(gòu)建:首先

3、設(shè)計(jì)長度為21個(gè)堿基的兩條隨機(jī)序列,作為實(shí)驗(yàn)組合的基本模塊,并在隨機(jī)序列的兩端分別設(shè)計(jì)九個(gè)堿基,這九個(gè)堿基順向互補(bǔ),作為一個(gè)通用的連接接頭,在PCR重聚時(shí)相互作為引物。選用的九個(gè)堿基是可編碼形成柔性氨基酸(linker)的堿基序列。隨機(jī)序列中間的21個(gè)堿基是隨機(jī)的,編碼7個(gè)氨基酸,達(dá)到形成一個(gè)蛋白模序(motif)所需要的氨基酸數(shù)目。因此,隨機(jī)序列通過PCR重聚就可以得到一個(gè)能夠編碼多種蛋白質(zhì)的一個(gè)隨機(jī)基因文庫。在重聚過程中,為了防止重