慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默F(xiàn)g12基因?qū)π募∥⒀軆?nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:原代分離培養(yǎng)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Myocardial MicrovascularEndothelial Cells MMVECs),通過免疫熒光鑒定。構(gòu)建人纖維介素(fgl2)的RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染MMVECs。轉(zhuǎn)染96小時后,qRT-PCR檢測fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、AKT2的表達(dá)。探討fgl2對MMVECs增殖、遷移的影響及其機(jī)制。
　　 方法:(1)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定:取

2、5-7天齡健康、清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠,取出心臟,洗凈血液,剪去心房及右心室,保留左心室,剝離心內(nèi)膜及心外膜。酒精滅活30秒。剪碎心肌組織,用胰蛋白酶及膠原酶Ⅱ消化,消化分離細(xì)胞,經(jīng)差速貼壁,獲得較純的MMVECs。待原代內(nèi)皮細(xì)胞長成單層融合后,進(jìn)行傳代。取第二代MMECs,免疫熒光檢測內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志物FVⅢ相關(guān)抗原及CD31相關(guān)抗原。
　　 (2)在GeneBank中查到人纖維介素fgl2(NM_00

3、6682)的堿基序列,設(shè)計4個SiRNA序列,并制備含正義鏈和反義鏈的雙鏈DNA oligo,退火合成雙鏈DNA(引物),與經(jīng)AgeI/EcoRI酶切pGCSIL—GFP載體連接,產(chǎn)生pGCSIL—Fgl2慢病毒載體,經(jīng)AgeI/EcoRI酶切電泳篩選陽性克隆,測序鑒定。pGC-LV、pHelper1.0、pHelper慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝生產(chǎn)慢病毒,以293T細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平來測定病毒滴度。
　　 (3)

4、實驗分組:取大鼠第三代MMVECs,實驗A組:單純MMVECs(對照組)；實驗B組；空載質(zhì)粒慢病毒(GFP組)；實驗C組:fgl2短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA；shRNA)慢病毒(fgl2-RNAi-LV組)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4天后,實時定量qRT—PCR(quantitative real-time RT—PCR,qRT-PCR)檢測各組fgl2、Ang1、Ang2、Tie2、AKT2的mRNA表達(dá)。MTT檢測細(xì)胞增殖。T

5、ranswell檢測細(xì)胞遷移能力。
　　 結(jié)果:(1)原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功,純度達(dá)95％左右,呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)。
　　 (2)免疫熒光法檢測,顯示90％以上細(xì)胞的FVⅢ、CD31陽性,FVⅢ主要分布在細(xì)胞胞漿,呈綠色熒光,CD31主要分布在細(xì)胞膜,呈紅色熒光。
　　 (3)酶切及DNA測序表明,fgl2shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。包裝慢病毒,測得濃縮病毒滴度為1*109TU/ml,轉(zhuǎn)染fgl2shR

6、NA慢病毒96 h后,70-80％的MMVECs表達(dá)GFP,qRT-PCR結(jié)果顯示,與實驗A組與B組比較,實驗C組的fgl2表達(dá)明顯下調(diào),Ang1、Ang2、Tie2、AKT2明顯上調(diào),MMVECs的增殖能力與遷移能力增強(qiáng)。具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),而實驗A組與實驗B組無明顯差異。
　　 結(jié)論:fgl2shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染fgl2shRNA慢病毒載體后MMVECs的fgl2表達(dá)水平明顯下調(diào),Ang1、Ang2