中國葡萄屬野生種抗白粉病基因原核表達與抗體制備.pdf

1、　　芪合成酶(STS)是催化植物體內芪類化合物合成的關鍵酶，乙醛脫氫酶(ALDH)是廣泛存在于動物、植物和微生物體內的一類酶，參與體內多種代謝途徑，目前它在植物抗病反應中的作用還有待進一步了解。本實驗室研究人員通過mRNA差異顯示技術(DDRT-PCR)及cDNA末端快速擴增技術(RACE)，從高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1中克隆分離得到中國野生葡萄STS基因、ALDH基因。本研究利用所獲基因通過構建該基因原核表達載體，試圖從體外表

2、達途徑對該基因的功能進行驗證，為該基因在基因工程上的進一步應用和研究提供依據，主要取得以下結果： 1.根據已獲STS基因、ALDH基因cDNA全長序列，分別設計一對特異性PCR引物，以華東葡萄白河-35-1的5’RACEcDNA第一鏈為模板，經PCR擴增，分別獲得大小約1200bp和1600bp的DNA片段，經過克隆測序。 2.將ALDH基因定向克隆到原核表達載體上pGEX-4T-1上，重組表達載體pGEX-ALDH同樣

3、經BamHI和SmaI雙酶切處理，切下片段與已知ALDH基因片段大小一致，證明ALDH基因正確連接到表達載體上，重組表達載體構建成功。將重組表達載體pGEX-ALDH轉化表達菌E.coliBL21中，經誘導培養(yǎng)后，未見有明顯特異性表達。 3.將STS基因從定向克隆到原核表達載體pGEX-4T-1上，重組表達載體pGEX-STS同樣經BamHI和XhoI雙酶切處理，切下片段與已知STS基因片段大小一致，證明STS基因正確連接到表達

4、載體上，重組表達載體構建成功。 4.GST-STS融合蛋白主要以包涵體形式表達，通過高濃度變性劑溶解包涵體和低濃度變性劑梯度透析對該包涵體進行了復性。復性的蛋白可通過GST親和介質進行富集、純化，為進一步研究基因的功能提供了依據。 5.以GST-STS融合蛋白包涵體作為抗原免疫家兔，獲得的多克隆抗血清按1：3000稀釋后，經Westernblotting檢測對目的蛋白特異性良好，能夠與復性、純化的GST-STS融合蛋白產