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文檔簡介
1、基因導入系統(tǒng)較低的轉染效率限制了基因轉移技術的治療效用,盡管病毒介導的載體系統(tǒng)可以具備相對較高的基因表達水平,但它在基因治療中插入或整合到染色體的位置是隨機的,有引起插入突變及細胞惡性轉化的潛在危險;非病毒載體系統(tǒng)的免疫原性較低,安全可靠,并適于大規(guī)模生產,在外源基因短暫表達中具有優(yōu)勢,并廣泛應用于各種DNA疫苗的研制,它的不足是體內轉導效率低,靶向性差,基因表達時間短。綜上,采用生物安全性較好的非病毒方式,如何增強外源基因表達,進而延
2、長基因治療的時間,受到人們越來越多的關注。
另一方面,重組蛋白表達技術是研究蛋白質結構、功能,及篩選靶向藥物的有力工具,在基礎科學以及醫(yī)藥學領域發(fā)揮了重要作用。截至目前,人們已經研究開發(fā)出多種原核和真核表達系統(tǒng)用以生產重組蛋白。原核表達系統(tǒng)方便,便宜、周期短,但有些蛋白折疊不好,不帶有糖基化等修飾;而哺乳動物表達系統(tǒng)——作為典型的真核表達系統(tǒng),主要用于制備分泌的重組蛋白。相較于其他表達系統(tǒng)的宿主,它具有最出色的蛋白質折疊和二硫
3、鍵形成能力,表達出的蛋白最接近天然蛋白,有利于蛋白結構和功能研究,但也存在著產量低,培養(yǎng)成本較高的劣勢。因此,人們期望發(fā)明一種簡單高效的瞬時表達系統(tǒng),提高重組蛋白的生產效率。此外,在利用重組釀酒酵母呈遞外源性DNA或RNA產生特異性抗體和殺傷性T細胞過程中,重組DNA疫苗引起特異性免疫反應可能較慢,產生特異性抗體的劑量較小。
Gal4/UAS系統(tǒng)是生物體中用于研究基因表達和功能的一種生物化學方法,本實驗中在CMV表達載體的基礎
4、上增加一種自動激活的Gal4/UAS表達盒從而增強基因表達。首先,Gal4/UAS系統(tǒng)中2個上游激活序列(2UAS),VP64,Gal4AD和VP64-p65-Rta三種DNA激活域進行比較,表達載體pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-Gal4BD-VP64的Luciferase表達量最高,大概是陰性對照組的16倍以上;然后將2UAS替換成4UAS,構建新的表達載體pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-
5、T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS,此表達載體激活的報告基因Luciferase的表達量是CMV啟動表達載體的近23倍;接著在HEK293T細胞上研究了增強基因表達的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)相比于陰性對照組,由表達載體pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS激活的報告基因Luciferase的表達水平從轉染后第6~10天一直維持較高水平的表達,在轉染后第8天達到了峰值。還在專門
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