五味子質量控制及血清藥化學研究.pdf

1、中藥藥效物質基礎研究是中藥現代化的核心和難點，目前沒有統(tǒng)一模式，傳統(tǒng)方法是成分分離后進行活性測試或活性引導下追蹤分離，采用傳統(tǒng)方法確實闡明了一些中藥的藥效物質基礎，但該法所確定的成分是否是藥效的代表性成分有時有待商榷。首先，中藥是多成分、多靶點的復雜體系，其藥效往往是多種成分在不同靶點整合的結果，化學分離使這種整合作用消失;其次，傳統(tǒng)的口服給藥形式決定了中藥中被吸收進入體內的物質才能產生活性，而且進入體內發(fā)揮作用的可能是原形成分，也可能

2、是代謝產物。因此，有學者提出了基于“含藥血清”的研究策略，其指導思想是:中藥要在體內產生效應，其效應成分應在預期的時間里以有效的濃度到達靶器官或組織，且必須由用藥部位進入血液循環(huán)，并以血液為介質輸送到靶器官或組織，因而可以把給藥后的血清（即含藥血清）作為中藥藥效物質基礎的研究對象。雖然吸收進入體內的成分不全是有效成分，但是經過胃腸道的處理，進入體內成分的種類和數目大大減少，這樣可以簡化中藥復雜體系，而且其確定的有效成分是體內直接產生藥效

3、的物質基礎。
　　基于“含藥血清”的中藥藥效物質基礎研究策略包括“血清藥理學(SerumPharmacology)”和“血清藥物化學（Serum Pharmacochemistry）”研究?！把逅幚韺W”指將含藥血清作用于體外細胞模型進行藥效評價;“血清藥物化學”指采用現代分析方法對含藥血清中的藥源性成分（包括體外原形成分和體內代謝產物）進行定性定量分析。兩者相結合研究可以基本闡明中藥的藥效物質基礎。
　　五味子（Schis

4、andra chinensis）是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，含有多種化學成分，具有多種藥理活性，其中聯苯環(huán)辛烯類木脂素（又稱五味子類木脂素）是其主要化學成分，也是主要活性成分，目前已從五味子中分離到該類成分50個。五味子類木脂素具有確切的保肝作用，其活性與結構有關，也與體內代謝過程有關，但對該類成分的構效關系及在體內真正發(fā)揮藥效的物質基礎目前的研究并無定論。因此

5、，采用血清藥化學方法研究五味子類木脂素的體內過程對闡明其保肝作用的藥效物質基礎及構效關系具有重要意義。
　　有鑒于此，本課題在對五味子進行質量控制及提取工藝等研究的基礎上，采用血清藥化學方法及指紋圖譜技術、LC-MS等檢測手段，對大鼠灌胃給藥后體內產生的原形五味子類木脂素成分及其代謝產物進行了定性定量研究。
　　論文分文獻綜述和實驗研究兩大部分。
　　第一部分，文獻研究。引用文獻83篇，綜述了五味子化學成分及五味子類木

6、脂素血清藥化學研究進展，在此基礎上簡要介紹了本課題的研究思路和方案設計。
　　第二部分，實驗研究。包括以下內容:
　　一、五味子質量控制及木脂素類成分提取工藝研究
　　1、基于指紋圖譜與一測多評法相結合的五味子質量評價方法研究
　　采用HPLC法測定了12批五味子樣品的指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，指紋圖譜標定共有峰24個，通過對照品比對，指認了其中6個木脂素類成分分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五

7、味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。12批樣品指紋圖譜的相似度均大于等于0.991。以五味子醇甲為內參物，建立了五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素與五味子醇甲的相對校正因子，一測多評法計算了各成分在12批樣品中的含量。同時采用外標法測定了12批樣品中以上6個木脂素類成分的含量，比較了計算值與實測值的差異，以驗證一測多評法的準確性。結果表明，建立的相對校正因子重現性良好，采用校正因子計算的含量值與實測值之間無顯著差異

8、。
　　2、五味子及其種子、果皮中6種木脂素類成分的含量比較
　　采用HPLC法對五味子種子和果皮中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等6種木脂素類成分進行了含量測定和分析比較。結果表明，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素在種子中的含量占果皮和種子總含量的平均值分別為91.23％、87.49％、95.10％、90.76％、93.43％和90.54％。提示

9、五味子中木脂素類成分主要存在于種子中。
　　3、五味子種子中木脂素類成分提取工藝研究
　　以五味子總木脂素類和6種主要木脂素提取量加權作為指標，以回流次數、回流時間、乙醇濃度和乙醇用量為考察因素，每個因素設3個水平，選用L9(34)正交表安排試驗優(yōu)選了五味子種子中木脂素類成分提取工藝，方差分析結果表明，回流次數、回流時間對木脂素類成分提取率有顯著影響，乙醇濃度和乙醇無明顯影響，最終優(yōu)選的提取工藝為6倍量95％乙醇回流3次，每

10、次60min。
　　4、五味子種子提取物指紋圖譜研究及木脂素類成分含量測定
　　采用HPLC法測定11批五味子種子提取物的指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，11批樣品指紋圖譜標定了共有峰24個，通過對照品比對，指認了其中6個木脂素類成分分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素。11批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均＞0.994。采用與藥材含量測定相同的一測多評與外標法相結合的方法，測定

11、了提取物中上述6種木脂素類成分的含量，并對兩種方法的測定結果進行了比較，結果表明，兩種方法的測定結果無顯著差異。
　　二、五味子種子提取物血清藥化學研究
　　1、五味子種子提取物含藥血清指紋圖譜研究
　　雄性SD大鼠一次性灌胃給予五味子種子提取物（折算成五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的劑量分別為29.44、8.45、7.76和14.2mg/100g）后6h采集血漿，采用與五味子指紋圖譜的相同的色譜條件測

12、定了10批含藥血漿HPLC指紋圖譜，建立了指紋圖譜共有模式，通過與空白血漿圖譜比較，標定了10批含藥血漿中代表藥源性成分的共有峰16個，與提取物及對照品指紋圖譜比對發(fā)現，16個共有峰中體內代謝產物9個，原形成分7個，其中4個原形成分分別被指認為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素。
　　2、五味子提取物及其含藥血漿中木脂紊類成分的UPLC-ESI/MS分析
　　采用UPLC-ESI-MS對五味子種子提取物及其大鼠灌

13、胃給藥后的含藥血漿中的藥源性成分進行定性分析。結果發(fā)現，提取物中含五味子類木脂素29個，通過對照品比對，其中的5個分別被鑒定為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，參考相關文獻推測了其余24個的結構。大鼠灌胃五味子種子提取物后，體內產生了28個藥源性成分，其中原形成分17個，代謝產物11個，17個原形成分中4個被鑒定為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素，未檢測到五味子酯甲，參考相關文獻推測其余13個成分

14、分別為異五味子醇甲、戈米辛D、巴豆酰戈米辛H、當歸酰戈米辛H、戈米辛F、五味子酯乙、五味子酚、巴豆酰戈米辛P、Gomisin M1、表戈米辛O、戈米辛N、苯甲酰異戈米辛O和五味子丙素。參考相關文獻推測11個代謝產物中的10個分別為7，8-順二羥基-3-去甲基五味子醇甲、戈米辛H的異構體、戈米辛P、7，8-順二羥基-2-去甲基五味子醇甲、戈米辛H、7，8-順二羥基五味子醇甲、戈米辛（戈米辛的異構體）、Deangeloylgomisin B

15、、五味子醇甲（五味子醇乙或五味子甲素）的代謝物、五味子乙素的代謝物;還有一個有待鑒定。
　　3、五味子提取物中4種木脂素與其單體的藥代動力學初步比較
　　雄性SD大鼠，一次性灌胃給予五味子種子提取物、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h采取血漿，通過比較醇提物和單體成分的血藥濃度-時間數據，發(fā)現五味子醇甲和五味子醇乙的藥動行為可能受其他木