虎皮楠生物堿體外抗腫瘤活性成分篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：對從虎皮楠和牛耳楓中提取的虎皮楠生物堿進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，得到有效的抗腫瘤化學(xué)成分，并對其中的有效成分做進(jìn)一步研究，以探明其抗腫瘤的作用機(jī)制，為該類化合物中新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、采用MTT法測定8種虎皮楠生物堿對A-549（人肺腺癌細(xì)胞株）、MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞株）、HepG-2（人肝癌細(xì)胞株）、HeLa（人宮頸癌細(xì)胞株）和U-251（人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株）等5種腫瘤細(xì)胞

2、株的體外抗腫瘤活性，分別計(jì)算在24h、48h、72h后8種虎皮楠生物堿對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，以篩選抗腫瘤活性較強(qiáng)的成分及敏感腫瘤細(xì)胞株；
　　 2、對篩選出的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用較強(qiáng)的4種虎皮楠生物堿deoxycalyciphyllineB、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H做縮小各化合物的濃度梯度跨度（倍比稀釋）的處理，以便更好地觀察藥物在

3、不同時(shí)間、不同濃度時(shí)的作用效果以及時(shí)效、量效關(guān)系；
　　 3、對篩選出的抗腫瘤活性最好的化學(xué)成分Daphnioldhanin E和較敏感的HepG-2細(xì)胞，通過瑞一姬染色光學(xué)顯微鏡觀察、FDA-PI雙染熒光顯微鏡觀察、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀檢測及蛋白酶學(xué)分析等手段，初步探討Daphnioldhanin E在細(xì)胞、分子水平的抗腫瘤作用機(jī)制，為進(jìn)一步的生物學(xué)活性研究奠定基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：
　　 1、虎皮楠

4、生物堿抗腫瘤活性的初步篩選
　　 結(jié)果顯示：8種虎皮楠生物堿中deoxycalyciphylline B、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H等四種生物堿對所用的五種腫瘤細(xì)胞株均有一定的抑制作用，尤其是對HepG-2細(xì)胞的作用最為明顯，其IC50在72h后分別達(dá)到了4.94、2.24、1.17、3.44μg/mL;
　　 2、時(shí)效、量效關(guān)系的研究
　

5、　 隨著藥物濃度逐漸增加，4種虎皮楠生物堿對HepG-2細(xì)胞的抑制率也隨之增加，且抑制作用具有較好的時(shí)效和量效關(guān)系。此外，上述4種化合物在72h的IC50均小于1Oμg/mL，并且有明確的劑量依賴性關(guān)系，其中Daphnioldhanin E的作用效果最好，在24h、48h、72h的IC50分別達(dá)到了5.70、1.29、0.75μg/mL;
　　 3、作用機(jī)制的研究
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察：瑞姬氏染色的光學(xué)顯微鏡下觀察到

6、HepG-2細(xì)胞經(jīng)小劑量（lOμg/ml)的Daphnioldhanin E處理后，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核清晰可見，周圍出現(xiàn)了大量的胞漿空泡，但細(xì)胞膜仍保持完整，而隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞膜完整性開始遭到破壞，最終致細(xì)胞核破碎，且伴隨著整個(gè)細(xì)胞的密度大幅降低；
　　 (2) DNA梯帶電泳：瓊脂糖凝膠電泳檢測Daphnioldhanin E作用HepG-2細(xì)胞后，電泳中出現(xiàn)了大量50-200bp小片段，未見凋亡特征

7、性的DNA梯狀條帶；
　　 (3)流式細(xì)胞儀檢測：小劑量的Daphnioldhanin E(1Oμg/mL)在作用HepG-2細(xì)胞24、48、72h_個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，早期凋亡細(xì)胞的凋亡率較對照組無明顯變化(P>0.05)，晚期凋亡率和壞死率明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而大劑量組(30μg/mL)在24、48、72h_個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，早期凋亡細(xì)胞的凋亡率較對照組有所增加(P<0.05)，但比例不大，分別為（6.34±0.8

8、9）％、（9.16±0.32）％、（11.67±0.40）％；晚期凋亡率和壞死率亦明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 (4)熒光顯微鏡觀察：在作用24h后，空白對照組和Daphnioldhanin E組以綠色熒光為主，表明以上兩組細(xì)胞胞膜未發(fā)生破損，PI未能染色，提示Daphnioldhanin E在作用于HepG-2細(xì)胞的早期未出現(xiàn)大量壞死，而凋亡陽性對照組紅色熒光明顯增多，表明細(xì)胞壞死或晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加

9、；
　　 (5)凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對Daphnioldhanin E抑瘤活性影響的研究：兩個(gè)濃度的Daphnioldhanin E未受Z-VAD-FMK的影響，殺傷作用明確；
　　 (6) caspase3酶活性的檢測：Daphnioldhanin E處理組與正常對照組比較，HepG-2細(xì)胞caspase-3酶活力值無明顯變化，說明細(xì)胞死亡過程中caspase-3沒有被活化。
　　 結(jié)論：
　　

10、 1、8種虎皮楠生物堿中有4種(deoxycalyciphylline B、Daphnioldhanin D、Daphnioldhanin E、daphnioldhanine H)對五種組織來源的腫瘤細(xì)胞株有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間劑量依賴性，其中Daphnioldhanin E對HepG-2細(xì)胞的抑瘤活性最強(qiáng)；
　　 2、Daphnioldhanin E可能通過誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生亞凋亡(Paraptosis)而發(fā)揮抗腫瘤