毛竹木質(zhì)素單體生物合成相關(guān)基因的分離、表達(dá)與功能初步鑒定.pdf

1、毛竹（Phyllostachys edulis）屬于禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）剛竹屬（Phyllostachys），是我國栽培面積最大、經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值最高的竹種。毛竹含有豐富的纖維素，適合作造紙?jiān)?。然而，在毛竹制漿造紙工業(yè)中，由于原材料富含木質(zhì)素，必須利用大量的化學(xué)品將原料中的木質(zhì)素與纖維素分離，纖維素用于造紙，而分離的木質(zhì)素形成造紙廢液，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且脫木質(zhì)素的化學(xué)藥品投入及廢液的堿回收處

2、理大大增加了造紙成本。通過生物技術(shù)手段改變木質(zhì)素含量或木質(zhì)素單體組成，定向培育適合工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需的毛竹新品種，已成為當(dāng)前毛竹生物技術(shù)領(lǐng)域中一項(xiàng)重要的研究課題。
　　本項(xiàng)研究構(gòu)建了毛竹不同器官全長(zhǎng)cDNA文庫，在大規(guī)模測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，從cDNA文庫中分離克隆了編碼木質(zhì)素單體合成途徑中幾個(gè)關(guān)鍵酶的基因，即香豆酸-3-羥基化酶（C3H）、肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）的編碼基因，以及阿魏酸5-羥基化酶類似基

3、因（F5H-like），著重研究了C3H、F5H-like基因的表達(dá)模式，并通過轉(zhuǎn)基因的方法初步研究了F5H-like基因的可能功能，得出以下結(jié)論。
　?。?）從毛竹全長(zhǎng)cDNA文庫中分離得到了5個(gè)CCR基因。5個(gè)CCR蛋白具有表異構(gòu)酶（Epimerase）結(jié)構(gòu)域，屬于依賴于 NAD的表異構(gòu)酶/脫水酶（NAD dependent epimerase/dehydratase）家族的氧化還原酶；毛竹5個(gè)CCR蛋白中有4個(gè)沒有明顯的信號(hào)

4、肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，推測(cè)定位在細(xì)胞質(zhì)中；PheCCR5的N端具有類似信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，它可能定位于線粒體中。采用最大似然法對(duì)CCR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，CCR蛋白家族起源于真核生物分化之前，高等植物中CCR蛋白的多樣性源自于種屬特異的基因擴(kuò)增和多樣化事件。
　?。?）從毛竹全長(zhǎng)cDNA文庫中分離得到了5個(gè)CAD基因。毛竹5個(gè)CAD蛋白中，有4個(gè)具有醇脫氫酶GroES-like（ADH_N）和鋅結(jié)合脫氫酶（AD

5、H_zinc_N）兩個(gè)保守功能域，這是大多數(shù)CAD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；另外一個(gè)具有與CCR蛋白相同的Epimerase結(jié)構(gòu)域，但全蛋白序列與CCR蛋白相似性不高，屬于另一類CAD蛋白，即具有Epimerase結(jié)構(gòu)域的CAD蛋白，這類CAD與具有ADH_N和ADH_zinc_N兩個(gè)保守功能域的CAD蛋白的相似性極低。采用最大似然法對(duì)兩類CAD蛋白分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明， 高等植物的具有醇脫氫酶GroES-like和鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)

6、域的CAD蛋白處于2個(gè)進(jìn)化枝上，這種分化可能發(fā)生在高等植物產(chǎn)生之前；高等植物產(chǎn)生以后，一些植物的基因組內(nèi)又發(fā)生了基因擴(kuò)增和多樣化事件，產(chǎn)生了多個(gè)CAD同源基因。高等植物的具有Epimerase結(jié)構(gòu)域的CAD蛋白，在高等植物產(chǎn)生之后有一個(gè)共同的祖先。
　　（3）在毛竹全長(zhǎng)cDNA文庫中找到1個(gè)推定的毛竹C3H基因，命名為PheC3H。其編碼蛋白PheC3H分子量為58.38kDa，理論等電點(diǎn)為8.77。PheC3H蛋白與小麥的CYP

7、98A相似性最高，PheC3H應(yīng)屬于CYP98家族A亞家族蛋白。PheC3H的前21個(gè)氨基酸殘基推定為信號(hào)肽區(qū)域，成熟蛋白很可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。采用實(shí)時(shí)定量PCR研究了PheC3H在毛竹幼苗不同營養(yǎng)器官中的表達(dá)，結(jié)果表明，PheC3H在3年生莖中表達(dá)量最高，其次是一年生葉鞘；在一年生毛竹不同營養(yǎng)器官中的表達(dá)量順序?yàn)椋喝~鞘>根>葉片>莖。
　?。?）采用同源比對(duì)的方法，在毛竹全長(zhǎng)cDNA文庫中找到10個(gè)與高等植物F5H基因序列和相應(yīng)

8、的編碼蛋白質(zhì)序列相似性較高的基因。對(duì)其編碼蛋白的序列分析表明，這10個(gè)基因的編碼蛋白質(zhì)均屬于細(xì)胞色素P450家族成員，10個(gè)基因初步命名為PheCYP-1,?, PheCYP-10。10個(gè)基因及其編碼蛋白相互之間的相似性不高；10個(gè)P450蛋白與高等植物已經(jīng)報(bào)道的F5H蛋白相似性也不高，因此這10個(gè)基因可能具有不同的功能。PheCYP-2屬于 CYP81A亞家族，PheCYP-4屬于 CYP81家族，PheCYP-5屬于CYP706家族

9、一新的亞家族，PheCYP-9可能是一個(gè)類黃酮-3?5?-羥基化酶。10個(gè)P450蛋白均含有N端信號(hào)肽，很可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。
　?。?）采用實(shí)時(shí)定量PCR研究了10個(gè)PheCYP基因在毛竹幼苗不同營養(yǎng)器官中的表達(dá)情況，根據(jù)相對(duì)表達(dá)水平，10個(gè)PheCYP基因可以分成3組：①高表達(dá)基因，有3個(gè)：PheCYP-1、PheCYP-2和PheCYP-7，PheCYP-1和PheCYP-2主要在葉片中表達(dá)，PheCYP-7主要在筍中表達(dá)

10、；②中度表達(dá)基因，有4個(gè)，包括 PheCYP-3、PheCYP-4、PheCYP-6和PheCYP-9，PheCYP-3主要在葉片、莖和根中表達(dá)，PheCYP-4主要在葉片中表達(dá)，PheCYP-6主要在筍中表達(dá)，PheCYP-9主要在葉鞘和莖中表達(dá)；③低表達(dá)基因，有3個(gè)，包括PheCYP-5、PheCYP-8和PheCYP-10，PheCYP-5主要在筍中表達(dá)，PheCYP-8主要在筍、根和葉鞘中表達(dá)，PheCYP-10主要在葉片中表達(dá)

11、。根據(jù)已報(bào)道的F5H基因及木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)模式推測(cè)，這10個(gè)基因可能與木質(zhì)化進(jìn)程有關(guān)。
　?。?）對(duì)PheCYP-5、PheCYP-6和PheCYP-10基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，目前已經(jīng)得到了3個(gè)基因的T1代轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)PheCYP-5和PheCYP-10基因的T1代擬南芥花葶的木質(zhì)部發(fā)育情況進(jìn)行切片觀察，結(jié)果表明，過表達(dá) PheCYP-5和PheCYP-10基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥，次生木質(zhì)部中導(dǎo)管壁的厚度顯著增