雜色曲霉素、乙醇聯(lián)合染毒致人肝細胞Hep G2 DNA鏈斷裂機制研究.pdf

1、目的:研究發(fā)現(xiàn)雜色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)作為繼黃曲霉毒素之后的第二大真菌毒素，廣泛存在于自然界中，可污染多種糧食作物，在ST污染嚴重的地區(qū)，居民患有胃癌和肝癌的機率高于其他地區(qū)。而乙醇的攝入在近些年來也逐漸增加，長期大量的飲酒可誘發(fā)多種疾病，尤其是肝損害。在日常生活中，人們可能同時攝入兩種物質(zhì)，我們猜想是否有毒物質(zhì)的聯(lián)合攝入比單一攝入對身體健康傷害更大。因此，本實驗以體外實驗為研究手段，探究乙醇和ST的聯(lián)合處理

2、是否可增加這2種毒物肝損傷程度;并從氧化應激和溶酶體膜穩(wěn)定性兩個方面來探討其DNA損傷的機制。
　　 方法:實驗體系選定人肝細胞HepG2，實驗步驟如下:1.采用MTT細胞存活率實驗，確定染毒劑量;金正均法計算合并效應相關(guān)系數(shù)，確定兩者相互作用關(guān)系。2.采用單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗檢測HepG2細胞DNA的損傷狀況;用Hoechst33258染色檢驗細胞凋亡。3.采用2'，7'二氫二氯熒光素(DCFH)染色法檢測HepG2

3、細胞中ROS的水平。4.熒光色素吖啶橙(Acridineorange，AO)染色法測定HepG2細胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性。5.應用SPSSv11.5統(tǒng)計軟件包對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:1.MTT實驗結(jié)果顯示ST的IC50為10.1μg/mL，乙醇的IC50為1190.4μg/mL。乙醇240μg/mL和ST1μg/mL聯(lián)合作用處理HepG2細胞24h后，聯(lián)合系數(shù)為q=0.99，呈單純相加作用。2.HepG2細胞在ST0

4、.5、1和2μg/mL分別處理0.5、1和2h，乙醇60、120和240μg/mL分別處理1h后引起DNA斷裂，細胞出現(xiàn)彗星樣的拖尾，尾長的增長同對照組相比呈劑量依賴關(guān)系，并具有統(tǒng)計學意義。聯(lián)合處理0.5h后HepG2細胞開始出現(xiàn)DNA損傷。ST和乙醇聯(lián)合作用2h處理后，細胞損傷程度加劇且細胞凋亡的數(shù)量大于10％。3.ST、乙醇單獨處理HepG2細胞0.5h后可引起ROS生成量增加，聯(lián)合處理組ROS的生成量與單獨乙醇處理組相比增加。4.

5、HepG2細胞在ST單獨處理1h或乙醇處理0.5h后，溶酶體膜穩(wěn)定性開始發(fā)生變化。在不同劑量乙醇中聯(lián)合使用1μg/mLST染毒1h，可測得的細胞AO熒光強度達到頂峰，2h聯(lián)合染毒處理組時發(fā)生回落，總體較乙醇單獨染毒處理組有顯著性差異。
　　 結(jié)論:與乙醇單獨作用相比，雜色曲霉素和乙醇的混合處理會降低細胞存活率，增加HepG2細胞DNA鏈斷裂程度，加劇DNA損傷。其作用機制可能是乙醇和ST聯(lián)合作用均可造成細胞損傷且其損傷一部分原因

6、與溶酶體途徑以及氧化應激途徑有關(guān)。ST和乙醇聯(lián)合處理可引起細胞內(nèi)ROS的和AO熒光值強度的增加，且增加量與時間和劑量有一定的依賴關(guān)系。聯(lián)合染毒處理2h后，細胞損傷繼續(xù)加劇，與乙醇單獨處理組相比，ROS生成量和AO熒光強度沒有顯著增加，AO熒光強度反而比乙醇單獨作用減少，可能與凋亡細胞增多有關(guān)，這在彗星實驗中也得到驗證。因此ST和乙醇聯(lián)合處理HepG2細胞誘發(fā)DNA損傷加劇的原因可能一部分來自于氧化應激作用，一部分來自與溶酶體破裂對細胞D