低劑量棉酚和甾體激素聯(lián)合用藥對大鼠精子發(fā)生的影響.pdf

1、女性避孕藥已經(jīng)成功應用了六十多年，但至今仍無安全、有效、無副作用的男性避孕藥面市。目前處于研究階段的男性避孕藥主要以甾體激素類藥物為主，但其不能完全有效、起效時間長、用藥方式（注射或皮下植入）不便等，為其推廣造成了很大障礙。本實驗室通過多年研究，發(fā)現(xiàn)低劑量棉酚與甾體激素聯(lián)合應用可以使大鼠較快、較好地達到抗生育效果，同時避免了單獨使用其中一種可能造成的一系列副作用的出現(xiàn)。經(jīng)過多年篩選，我們確定了低劑量棉酚與可口服的甾體激素——去氧孕烯+炔

2、雌醇+十一酸睪酮的聯(lián)合用藥方案。這個方案既能使全部受試大鼠在8w內(nèi)達到不育，又無明顯的毒副作用，但其作用靶點尚未闡明。
　　 大鼠隨機分為四組，喂服棉酚12.5mg/kg·d+去氧孕烯0.125mg/kg·d+炔雌醇0.025mg/kg·d+十一酸睪酮100mg/kg·d的聯(lián)合用藥組（GH組），單獨喂服相同劑量的棉酚組（G組）、單獨喂服相同劑量的激素組（H組）以及喂服載體溶劑的陰性對照組（C組）。分別于用藥后4、6、8和10w取

3、材，通過形態(tài)學觀察、組織勻漿計數(shù)精子數(shù)量、免疫組化染色、TUNEL原位細胞凋亡檢測、油紅O染色、Western blotting、RT-PCR及體外培養(yǎng)生精小管等多種方法，分別對精子發(fā)生過程中可能受到干擾的環(huán)節(jié)進行檢測，通過對各實驗組結(jié)果的比較，探討聯(lián)合用藥抗生育的具體作用環(huán)節(jié)以及棉酚和激素在用藥過程中各自所起的作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn): GH組每克睪丸組織所含的精子數(shù)量隨用藥時間增加而明顯下降，從4w時的與C組水平相當下降到10

4、w時的只有C組的26.4％;H組的精子數(shù)量下降的幅度雖然比GH組小，但到10w時數(shù)值已與GH組接近;而G組一直沒有明顯變化。對睪丸組織切片的觀察也證實GH組和H組的生精細胞隨著實驗時間的增加而逐漸減少，尤其以長形精子細胞最為明顯。8w時GH組近一半的生精小管中不含長形精子細胞，而此時H組大約只有10％的小管出現(xiàn)改變。到10w時H組長形精子細胞的數(shù)量明顯下降， GH組和H組之間的差異消失。此外，GH組和H組的初級精母細胞及圓形精子細胞的數(shù)

5、量也不斷減少。與此同時，我們觀察到GH組和H組附睪頭內(nèi)的成熟精子數(shù)量明顯減少，卻有大量圓形的生精細胞出現(xiàn)。G組的睪丸精子數(shù)量以及睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)方面都未見與C組有明顯差別。以上結(jié)果提示，GH組和H組的生精過程受到了干擾，致使發(fā)育到成熟階段的精子數(shù)量下降。
　　 通過對生精細胞增殖情況的檢查，發(fā)現(xiàn)各用藥組Ⅶ-Ⅷ期生精小管中的PCNA陽性細胞（精原細胞和細線前期的初級精母細胞）的數(shù)量基本無明顯變化，說明三個用藥組中精原細胞的增殖、分化未

6、受到明顯抑制。
　　 TUNEL染色檢查凋亡時發(fā)現(xiàn)從4w開始GH組和H組的凋亡細胞就明顯增多，而且隨用藥時間延長而不斷增加，10w時已分別達到C組的66倍和55.8倍了。凋亡主要發(fā)生在Ⅶ-Ⅷ期生精小管，主要的凋亡細胞種類為粗線期初級精母細胞，另外也有一些圓形精子細胞發(fā)生凋亡。GH組與H組的多個結(jié)果相近，比如凋亡細胞的總數(shù)、主要凋亡細胞類型和凋亡發(fā)生的主要階段等，但Ⅸ-Ⅵ期生精小管中GH組的凋亡細胞比H組多。這說明GH組的細胞凋亡

7、可能主要是激素作用導致的，而棉酚可能在此基礎上有強化作用。G組凋亡細胞的數(shù)量與C組相近，另外整個實驗過程中未發(fā)現(xiàn)精原細胞、間質(zhì)細胞和支持細胞凋亡。GH組和H組生精細胞大量凋亡可能是這兩組生精上皮中細胞減少的原因之一。
　　 支持細胞有吞噬并降解凋亡細胞的能力，生精上皮內(nèi)的脂滴增多常意味著被吞噬的凋亡細胞增多。油紅O染色結(jié)果顯示GH組和H組生精上皮中的脂滴面積明顯增多，而G組的脂滴面積沒有發(fā)生明顯改變。該結(jié)果間接證明GH組和H組大

8、量凋亡的細胞被支持細胞所吞噬，支持細胞的吞噬能力未受到明顯抑制。
　　 GH組和H組附睪管中出現(xiàn)的大量圓形生精細胞，提示生精細胞與支持細胞之間的粘附可能發(fā)生改變，致使大量未成熟的生精細胞提前脫落，因此我們對部分粘附分子在睪丸內(nèi)的表達情況進行檢測。Western blotting和免疫組化的結(jié)果顯示:GH組和H組的N-鈣粘蛋白的蛋白表達水平升高，并有隨時間繼續(xù)上升的趨勢，尤其以生精上皮中間層細胞（圓形精子細胞或初級精母細胞）之間的

9、表達增加得更為明顯。RT-PCR檢測也發(fā)現(xiàn)這兩組的N-鈣粘蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平在8w時比C組高，但各組間沒有顯著差異。同時，免疫組化結(jié)果顯示:整合素α6在GH組和H組的Ⅳ-Ⅷ期小管中圓形精子細胞之間的表達也隨時間增加而不斷增強。但是，整合素β1的變化趨勢與以上兩種粘附分子不同，它在GH組和H組生精上皮中間層的表達呈現(xiàn)下降趨勢，其中GH組下降的幅度更大。G組除了在Ⅸ-(XIV)期小管初級精母細胞的表達明顯比C組低外，其它階段都與C組類似。

10、以上3個粘附分子中只有整合素β1在中間層生精上皮的表達呈下降趨勢，提示整合素β1與生精細胞的脫落關(guān)系更為密切，而N-鈣粘蛋白和整合素α6的表達增加可能是由于生精細胞大量脫落而導致機體出現(xiàn)的代償反應。GH組比H組更為明顯的整合素β1的表達減少則提示棉酚可能在激素影響粘附分子表達的基礎上有進一步的協(xié)同作用。
　　 我們在睪丸組織切片還觀察到4-6W時，GH組和H組位于Ⅶ-Ⅷ期生精小管腔面的19期精子細胞明顯減少，但Ⅸ-Ⅺ期的小管腔面

11、卻又有一些精子細胞未能釋放;與此同時，Ⅶ-Ⅻ期生精上皮的基底部精子頭的數(shù)量明顯比C組多。G組一直沒有明顯改變。以上結(jié)果提示GH組和H組的19期精子細胞與支持細胞之間的粘附可能發(fā)生改變，或者19期精子細胞本身出現(xiàn)異常而被支持細胞大量吞噬。無論哪個原因都可以造成管腔面19期精子細胞數(shù)量的減少，而這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能主要是激素作用的結(jié)果。TUNEL法未檢測到長形精子細胞出現(xiàn)凋亡、另外我們也未發(fā)現(xiàn)所檢測的3個粘附分子在19期精子細胞周圍有明顯改變

12、，此處發(fā)生的改變還需要進一步檢測。體外實驗結(jié)果顯示低激素水平可以促使19期精子細胞從培養(yǎng)的正常生精小管脫落，其中GH組（培養(yǎng)液中含棉酚）的變化最為明顯，提示棉酚在激素作用的基礎上有協(xié)同促使19期精子細胞提前脫落的效應。
　　 我們對細胞信號轉(zhuǎn)導家族MAPKs的3個成員的活化形式——p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK的表達進行檢測，探索細胞信號轉(zhuǎn)導分子上述改變中的作用。結(jié)果顯示GH組和H組p-ERK在支持細胞的表達增加、

13、p-p38 MAPK在圓形精子細胞之間的表達增加，而p-JNK在無長形精子細胞的生精上皮中未見強陽性信號。p-ERK和p-p38MAPK在GH組和H組的表達變化分別與粘附分子N-鈣粘蛋白和整合素α6的表達變化有一定相似之處，提示它們可能參與細胞粘附改變的調(diào)節(jié)，但這還需要大量實驗證實。3個信號轉(zhuǎn)導分子的表達在G組未出現(xiàn)明顯改變。
　　 以上睪丸的各項實驗結(jié)果中GH組的數(shù)據(jù)多與H組較為接近，并與C組間存在顯著差異;另外GH組常比H組

14、更早出現(xiàn)與C組間的差距，且差距也比H組大;G組的結(jié)果則多與C組相近，二者間多無顯著差異。這說明聯(lián)合用藥在睪丸中以激素發(fā)揮主要作用，棉酚在此基礎上有協(xié)同作用。二者通過促進生精細胞凋亡、影響粘附分子的表達而增加生精細胞的脫落、增加長形精子細胞提前釋放或被吞噬等，最終導致睪丸的精子產(chǎn)量大幅度下降。
　　 在附睪中，三個實驗組的精子數(shù)量和活力隨用藥時間增加而明顯下降，10w時G組、H組和GH組附睪的精子數(shù)量分別只有C組的44.41％、4

15、0.16％和15.43％;同時，G組和H組分別只有14.00％和15.67％的可游動精子，而GH組基本未見可游動精子。另外各用藥組的精子畸形率也都在不斷增加，其中GH組的畸形精子出現(xiàn)得最早(4w)、數(shù)量也最多，10w時精子的畸形率高達91.17％，此時G組和H組的畸形率也分別達到了54.67％和63.83％。各組精子出現(xiàn)畸形的部位不完全相同:H組以精子頭尾分離為主;而G組除了有頭尾分離的精子外，尾部結(jié)構(gòu)不完整（線粒體鞘不完整、軸絲脫出、

16、尾部折斷等）的精子也在不斷增加;GH組的精子畸形則先以尾部異常為主，隨后頭尾分離的精子大量增加。各實驗組均未發(fā)現(xiàn)頭部異常的精子，附睪管上皮的形態(tài)也未發(fā)現(xiàn)明顯改變。
　　 附睪的實驗結(jié)果中GH組與C組間的差異最大，而G組和H組的數(shù)值常較為接近、并介于GH組與C組之間，提示棉酚和激素在附睪中都發(fā)揮作用、但作用的位點可能各不相同。在這兩種藥物的作用下，聯(lián)合用藥組的精子數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)和運動能力等都出現(xiàn)大幅度地改變。
　　 總之，

17、無論在睪丸還是在附睪，棉酚和激素都發(fā)揮重要作用。在睪丸中以激素的作用為主、棉酚有進一步協(xié)同的效果;而在附睪中二者的作用相當。通過棉酚和激素在睪丸和附睪中的多個環(huán)節(jié)的綜合作用，最終更快、更有效地降低了成熟精子的數(shù)量及其運動能力，達到比單獨使用其中任何一種更好的避孕效果。
　　 本實驗從形態(tài)學角度對聯(lián)合用藥可能在大鼠生精過程中造成的影響進行了詳細、系統(tǒng)地觀察和分析，并在此基礎上從粘附分子的角度對生精細胞脫落的可能原因進行了初步探索，