BoC-D-CMK經(jīng)鼻給藥對全腦缺血大鼠功能損害和神經(jīng)損傷的保護作用.pdf

1、目的:
　　1.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑Ⅳ（caspase-1 InhibitorⅣ，Boc-D-CMK; caspase-1抑制劑的一種）是否能減輕全腦缺血再灌注誘導的炎癥。
　　2.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK是否能減輕全腦缺血再灌注誘導的凋亡及神經(jīng)元損傷。
　　3.利用大鼠四動脈阻斷全腦

2、缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK是否對全腦缺血再灌注誘導的功能損害有保護作用。
　　4.利用大鼠四動脈阻斷全腦缺血模型，探討caspase-1參與保護全腦缺血再灌注誘導的神經(jīng)元損傷的可能機制。
　　方法:
　　1.清潔級健康SD大鼠6只，雄性，應(yīng)用生物素標記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥12小時后處死大鼠，利用共聚焦顯微鏡顯像觀察生物素標記的caspase-1抑制劑在腦內(nèi)的分布情況。

3、>　　2.清潔級健康SD大鼠12只，雄性，在大鼠四動脈結(jié)扎全腦缺血模型中，采用分光光度比色法檢測缺血再灌注后不同時間點caspase-1的活性。
　　3.清潔級健康SD大鼠48只，雄性，隨機分為三組:假手術(shù)對照組;缺血組;缺血+Boc-D-CMK組（治療組）。采用大鼠四動脈結(jié)扎全腦缺血模型，應(yīng)用免疫印跡、免疫組化研究蛋白表達量的變化，采用分光光度計比色法檢測酶的活性，采用ELISA的方法檢測炎癥因子的分泌，利用免疫熒光和激光共聚焦

4、技術(shù)觀察蛋白的表達、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元存活和線粒體的膜電勢，采用焦油紫染色和TUNEL染色研究海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞存活和凋亡，應(yīng)用巴恩斯迷宮和新物體識別實驗判斷大鼠的學習記憶、記憶缺失等神經(jīng)功能損害。
　　結(jié)果:
　　1、成年雄性SD大鼠海馬CA1區(qū)caspase-1蛋白的表達
　　首先，我們觀察了在不進行缺血的假手術(shù)大鼠海馬CA1區(qū)caspase-1蛋白的基礎(chǔ)表達。采用免疫熒光染色法檢測caspase-1、微管相關(guān)

5、蛋白(Microtubule associatedprotein-2，MAP2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)顯示了caspase-1在大鼠海馬CA1區(qū)的表達，且結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-1在海馬CA1區(qū)與MAP2和GFAP共染，提示caspase-1在在大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在全腦缺血再灌注后第三天和第十四天，caspase-1在海馬CA1區(qū)星

6、形膠質(zhì)細胞存在明顯的過表達。
　　2、生物素標記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥后在中樞神經(jīng)的分布
　　應(yīng)用生物素標記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥12小時后處死大鼠，取腦片常規(guī)處理后加入二抗，利用共聚焦顯微鏡顯像觀察了生物素標記的caspase-1抑制劑在腦內(nèi)的分布，結(jié)果提示caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥后可以滲入大鼠腦內(nèi)，且證實藥物可以分布在缺血敏感的海馬CA1區(qū)，caspase-1抑制劑主要分布在海馬和皮層神經(jīng)

7、元的細胞漿內(nèi)。
　　3、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)caspase-1的過表達和caspase-1的活性
　　首先該研究測定了大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)caspase-1活性的時間曲線。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與缺血前相比，在大鼠全腦缺血再灌注后所有時間點caspase-1活性均增加，大鼠全腦缺血再灌注后第3天前后達到高峰，第5天仍維持在較高水平。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)

8、經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK可明顯抑制大鼠全腦缺血再灌注后第3天海馬CA1區(qū)活化的caspase-1，且這種活化的caspase-1多在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)表達。
　　4、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以改善全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體功能
　　經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能逆轉(zhuǎn)全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，M

9、MP)變化，能明顯增加線粒體細胞色素C氧化酶活性，免疫印跡法結(jié)果分析進一步表明，Boc-D-CMK能減少全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)細胞色素C從線粒體向細胞漿的釋放，從而增加細胞色素C在線粒體的含量，可能減輕全腦缺血對神經(jīng)元線粒體功能的損害。
　　5、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導的海馬CA1區(qū)活化的caspase-9和活化的caspase-3的激活
　　共聚焦結(jié)果顯

10、示，在大鼠全腦缺血再灌注第3天，活化的caspase-9和活化的caspase-3的活性顯著增加。通過雙重免疫熒光染色研究表明，活化的caspase-9和活化的caspase-3與神經(jīng)元特異性核蛋白(Peuronal-specific nuclear protein，NeuN)陽性細胞共染，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能明顯減少共染的活化的caspase-9及活化的caspase-3的激活。
　　6、經(jīng)鼻給予caspase-

11、1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導的海馬CA1區(qū)的凋亡
　　免疫熒光染色顯示，在全腦缺血再灌注后第3天，全腦缺血再灌注誘導海馬CA1區(qū)細胞層TUNEL陽性細胞數(shù)和聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP1)陽性細胞數(shù)明顯增加，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能顯著減少TUNEL陽性細胞數(shù)和PARP1陽性細胞數(shù)的增加。
　　7、經(jīng)鼻給予caspase-1

12、抑制劑Boc-D-CMK后處理能減少全腦缺血誘導的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活和星形膠質(zhì)細胞的活化
　　首先，Western blotting檢測結(jié)果顯示，在全腦缺血再灌注后第3天，海馬CA1區(qū)離子鈣接頭蛋白抗體（Ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba1）和GFAP含量與假手術(shù)對照組相比明顯增加，表明在全腦缺血再灌注早期階段即誘導膠質(zhì)細胞增生，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理

13、可明顯降低Iba1和GFAP的增加。共聚焦顯微鏡結(jié)果提示，在全腦缺血再灌注后第14天，缺血再灌注誘導小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理可抑制小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活或活化。
　　8、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可抑制海馬CA1區(qū)全腦缺血再灌注誘導的炎性細胞因子的產(chǎn)生和減少神經(jīng)元死亡
　　在全腦缺血再灌注后第3天，海馬CA1區(qū)炎性細胞因子IL-1β、IL-18、IL-

14、6和TNF-α分泌顯著增加，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理明顯抑制了海馬CA1區(qū)炎性細胞因子的產(chǎn)生。通過焦油紫染色、NeuN染色共聚焦顯微鏡顯像進行的組織學評價，證實全腦缺血再灌注可誘導缺血易損的海馬CA1區(qū)局部神經(jīng)元死亡，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理顯著增加全腦缺血再灌注后第14天海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量。
　　9、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理能改善大鼠全腦缺血再灌注誘導的空間學習記憶能力障礙

15、，能顯著增強缺血后大鼠的新物體識別的長程記憶能力。
　　應(yīng)用巴恩斯迷宮評估大鼠海馬依賴的空間學習和記憶能力發(fā)現(xiàn)，全腦缺血再灌注后大鼠定位到目標逃離暗箱的時間明顯延長，并且在探索階段測試中，在目標逃離暗箱所在四分之一象限停留的時間縮短，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠空間學習與記憶能力。由于海馬的完整性還與如新物體識別記憶能力的非空間的學習記憶能力有關(guān)，本研究應(yīng)用新物體識別試驗評估各組大鼠，發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注后的大鼠對新

16、物體的識別指數(shù)降低，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠新物體識別能力的下降。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)鼻給予的Boc-D-CMK能進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨后發(fā)揮抑制caspase-1的活性，降低神經(jīng)元線粒體的功能損害，抑制缺血易損的海馬CA1區(qū)活化的caspase-3、活化的caspase-9和凋亡，能增加神經(jīng)元的存活數(shù)量。
　　2.經(jīng)鼻給予的Boc-D-CMK改善大鼠全腦缺血導致的學習記憶障礙、長程識別能力下降。<

17、br>　　3.進一步的研究表明，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制如下:抑制過度膠質(zhì)活化、抑制下游促炎因子減輕神經(jīng)炎癥的反應(yīng)、顯著增加海馬CA1區(qū)NeuN-陽性細胞數(shù)而減少TUNEL-陽性細胞數(shù)和PARP1-陽性細胞數(shù)。
　　總之，本研究表明，經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK能通過調(diào)節(jié)抗炎和抗凋亡的作用以減少大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細胞死亡，使其功能損害得以改善。該研究提示，抑制casp