基于納米技術(shù)的高通量自動(dòng)化單堿基差異檢測(cè)方法研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是人類(lèi)基因序列中最常見(jiàn)的變異，也是醫(yī)學(xué)診斷或生物信息與疾病及藥效關(guān)聯(lián)的研究重點(diǎn)，對(duì)其研究有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)復(fù)雜疾病的易感性以及對(duì)各種藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因子的反應(yīng)等，對(duì)其研究為新藥開(kāi)發(fā)和個(gè)體化醫(yī)療提供基礎(chǔ)。這種分析常常需要對(duì)多樣本多位點(diǎn)進(jìn)行高通量并行分析，但國(guó)家缺少具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的技術(shù)平臺(tái)，因此研發(fā)快速、準(zhǔn)確、高通量且高靈活性的SNPs分析檢測(cè)系統(tǒng)非常重要。
　　 基于上述重大

2、需求，在本論文中，我們將磁分離技術(shù)、磁性顆粒微陣列技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)與自動(dòng)磁分離工作站系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一系列高通量、自動(dòng)化、高特異性以及高實(shí)用性的單堿基差異檢測(cè)新方法及輔助平臺(tái)，并圍繞著這一目的開(kāi)展深入的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。具體內(nèi)容包括：
　　 1.鏈親和素修飾金磁納米顆粒的制備
　　 首先合成了包被有膠體金的金磁納米顆粒(Gold coated magnetic nanopartieles，GMNPs)，然后，分別通過(guò)使

3、用物理吸附與共價(jià)結(jié)合的方法制備鏈親和素-金磁納米顆粒。利用半胱胺(Cysteamine，CE)和11’巰基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic Acid,MUA)做為手臂分子在金磁復(fù)合顆粒表面共價(jià)修飾鏈親和素。多種分析結(jié)果證明利用MUA和CE共價(jià)修飾的鏈親和素-金磁納米顆粒，鏈親和素在其表面固定牢固，熒光背景低，生物相容性好，非常適用于免疫檢測(cè)、核酸雜交等研究和實(shí)際應(yīng)用。由于利用MUA作為手臂分子比CE捕獲生物素標(biāo)記的寡

4、核苷酸序列更多一些，因此，利用MUA制各的鏈親和素.金磁顆粒被優(yōu)選用于構(gòu)建磁性顆粒微陣列。
　　 2.磁性顆粒微陣列與雙色熒光雜交的核酸檢測(cè)方法
　　 在上述成功制備鏈親和素修飾金磁納米顆粒后，我們進(jìn)一步提出了一種將金磁納米顆粒與生物芯片相結(jié)合的磁性顆粒微陣列技術(shù)，并應(yīng)用于核酸多態(tài)性分析。將DNA-金磁顆粒復(fù)合物點(diǎn)樣到底部固定有磁鐵的載玻片上構(gòu)建磁性顆粒微陣列，通過(guò)雙色熒光雜交進(jìn)行核酸多態(tài)性分析。應(yīng)用該方法成功地對(duì)來(lái)自2

5、4個(gè)樣本的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了分型，并將結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)改進(jìn)靶序列的擴(kuò)增方法，即利用不對(duì)稱(chēng)PCR直接擴(kuò)增出單鏈DNA，將捕獲有單鏈DNA的金磁納米顆粒復(fù)合物點(diǎn)樣到固定有磁鐵的載玻片上構(gòu)建磁性顆粒微陣列，通過(guò)與雙色熒光探針雜交實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣本的分型。由于避免了熱變性的步驟，使得該方法能夠適用于大多數(shù)商業(yè)化鏈親和素-金磁顆粒與自動(dòng)化工作站平臺(tái)，將大大擴(kuò)展該方法的應(yīng)用范圍。利用金磁納米顆粒作為載體完成分型操作，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，同

6、時(shí)還易于實(shí)現(xiàn)高并行、自動(dòng)化樣品的制備。通過(guò)磁性顆粒微陣列，我們還在同一個(gè)雜交框內(nèi)實(shí)現(xiàn)了多樣本的雜交反應(yīng)，大大降低了雜交反應(yīng)中對(duì)試劑與熒光檢測(cè)探針的用量。
　　 3.基于磁分離和延伸技術(shù)的單堿基差異檢測(cè)
　　 在上述研究基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步發(fā)展了將金磁納米顆粒與單堿基延伸技術(shù)相結(jié)合的高通量單堿基差異檢測(cè)方法。首先，將生物素標(biāo)記的特異性延伸引物(Biotinylated extensionprimer,BioEP)固定在修飾有

7、鏈親和素的金磁納米顆粒上，形成固相延伸引物。將包含有固相延伸引物、酶、靶序列以及熒光標(biāo)記的特定ddNTP單體的延伸反應(yīng)體系加入反應(yīng)微孔板內(nèi)進(jìn)行單堿基循環(huán)延伸。反應(yīng)后，純合型樣本只延伸上去一種熒光標(biāo)記ddNTP，而雜合型樣本延伸上兩種不同的熒光標(biāo)記ddNTP。最后將延伸有熒光單體的金磁納米顆粒點(diǎn)樣到載玻片表面構(gòu)建“磁性顆粒微陣列”，通過(guò)檢測(cè)顆粒表面熒光信號(hào)強(qiáng)度值確定樣本的基因型。利用單色熒光標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行延伸，我們對(duì)96個(gè)樣本的4個(gè)

8、位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)：接著我們又類(lèi)似地利用雙色熒光標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行延伸并成功地對(duì)320個(gè)樣本進(jìn)行了檢測(cè)。單堿基循環(huán)延伸方法的最大優(yōu)點(diǎn)是避免了任何基于雜交技術(shù)SNP分型方法中，由于錯(cuò)配探針雜交產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)，因此具有極高的準(zhǔn)確性，信噪比大于25。此外，我們將全基因組擴(kuò)增與基于磁分離的單堿基延伸技術(shù)相結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多樣本多位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。本文以磁性顆粒微陣列和單堿基延伸為基礎(chǔ)，成功實(shí)現(xiàn)了多樣本的在片延伸SNP檢測(cè)，拓展了磁性顆粒微陣列的

9、應(yīng)用范圍。
　　 4.自動(dòng)磁分離工作站
　　 雖然本論文所研發(fā)的檢測(cè)方法能夠適用于各種商業(yè)化自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)，但鑒于目前自動(dòng)化工作站的昂貴價(jià)格難以在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室推廣，為此，我們研發(fā)了同時(shí)具備磁分離功能和溫控功能的簡(jiǎn)易自動(dòng)磁分離工作站。該系統(tǒng)使用條形銣鐵硼強(qiáng)磁體組成一定形狀的磁鐵陣列，通過(guò)步進(jìn)電機(jī)控制螺旋絲桿來(lái)移動(dòng)磁鐵陣列以及市售96孔板的位置，使兩者相嵌合，這時(shí)各個(gè)微孔內(nèi)磁性納米復(fù)合顆粒連帶著其上特異性結(jié)合的生物大分子被吸附