副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表達和免疫原性研究.pdf

1、浙江大學博士學位論文副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表達和免疫原性研究姓名：毛芝娟申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：于漣20070401浙江大學博士學位論文摘要副溶血弧菌p硒砌parahaemolyticus是我國海水養(yǎng)殖魚、蝦、貝類的重要病原，每年由此菌引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的損失。在浙江省沿海網箱養(yǎng)殖中，該菌與哈維氏弧菌、溶藻弧菌等重要病原弧菌一起，主要危害大黃魚幼魚，每年

2、的高溫季節(jié)可弓l起大量的死亡。前期研究中以福爾馬林滅活的副溶血弧菌全菌苗免疫大黃魚，獲得了較好的保護效果。本研究開展該菌主要保護性抗原成份之——外膜蛋白的克隆、表達和免疫原性研究，為高效疫苗的研制提供依據。以飽和硫酸銨梯度鹽析法結合瓊脂糖柱sephadex(3200凝膠過濾法初步純化了大黃魚血清免疫球蛋白，再經割膠回收法得到進一步純化的重鏈片段，分子量約為75kDa，免疫新西蘭兔后獲得兔抗大黃魚免疫球蛋白血清，為ELIsA和Wester

3、nblotting檢測技術奠定了基礎。采用十二烷基肌氨酸鈉法(Sarkosyl)提取不同來源的4株副溶血弧菌分離株的主要外膜蛋自，通過SDSPAGE比較分析主要條帶和分子量組成。SDSP：AGE顯示4株菌的主要外膜蛋白由56條組成，分子量分布在2154kDa，其中，21kDa、28kDa和35kDa的條帶是所有菌株共有的，表明副溶血弧菌中部分主要外膜蛋白條帶可能是保守的。制備了不同抗血清，對4菌株的外膜蛋白進行免疫印跡分析表明，副溶血弧

4、菌的主要外膜蛋白具有免疫原性，全菌兔抗血清主要與一分子量為21kDa的主要外膜蛋白條帶發(fā)生印跡反應；感染后恢復期大黃魚血清識別分子量為21kDa、28kDa、35kDa和44kDa的蛋白條帶，可能與抗感染免疫應答有關；其中21kDa的條帶是所有抗血清均識別的，提示了該蛋白良好的免疫原性。以N端氨基酸測序法初步確定了21kDa的主要免疫原性外膜蛋自為ompW，設計引物從浙江省養(yǎng)殖大黃魚分離株萄2003株基因組DNA克隆到該蛋白成熟肽的編碼

5、序列，基因登錄號為QQ2!Q窆。亞克隆到原核表達載體pET30a中獲得重組載體pET30aompW，轉染大腸桿菌EscherichiacoliBL21，在IPTG誘導下表達出預期分子量(27kDa)的重組蛋自，重組蛋白以包涵體形式存在。以鎳柱親合層析法獲得純化的重組蛋白，免疫新西蘭兔獲得高免血清，該血清在免疫印跡中識別重組蛋白，提示了重組蛋白得到正確表達。重組蛋白同時被全菌兔抗血清和感染恢復期大黃魚血清所識別，進一步驗證了與21kDa外