自噬對T細胞穩(wěn)態(tài)的影響及其機制.pdf

1、自噬是細胞對自身細胞器或者蛋白分解的過程，也是機體保持穩(wěn)態(tài)的過程。自噬的基本過程包括將細胞漿成分隔離于雙層膜中形成自噬小體，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其中的細胞器或者蛋白被溶酶體中的蛋白水解酶降解并進入細胞的再循環(huán)過程，以滿足細胞在缺氧、感染、營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的物質(zhì)和能量需求，或清除壞死細胞器、長壽蛋白、脂質(zhì)等成分，維持細胞結(jié)構(gòu)成分的穩(wěn)態(tài)。
　　靜息的T細胞保持著低水平的自噬，T細胞通過TCR途徑激活之后自噬水平顯著提

2、高。自噬相關基因缺陷的動物模型表明自噬對于維持 T細胞的穩(wěn)態(tài)與存活起著重要作用。自噬參與抗原提程，各種抗原，包括病毒、腫瘤，自身和異位表達的蛋白等，可能通過自噬途徑被抗原提呈細胞(APC)MHCⅡ類分子提呈。自噬還與細胞的存活相關。一些重要的自噬相關基因的缺陷而使細胞不能進行自噬時,細胞很容易發(fā)生凋亡。自噬引起的細胞死亡也是一種細胞程序性死亡。在經(jīng)典的細胞凋亡過程中，細胞先降解細胞骨架，此時細胞器保留下來，直到凋亡后期，細胞器才被降解。

3、而自噬相關的細胞死亡，在早期就有細胞器被降解，細胞骨架在后期降解。自噬引起的細胞死亡與經(jīng)典的細胞凋亡都不會引起炎癥反應。自噬在機體的免疫過程中發(fā)揮著重要作用，自噬的功能缺陷，引發(fā)機體免疫功能紊亂和多種疾病。
　　目前針對自噬的研究在T細胞中研究相對較少。但是T細胞自噬功能缺陷，會影響T細胞的存活、功能、進而導致機體免疫功能紊亂，研究自噬對T細胞的影響及其具體機制尤為重要。我們通過Beclin1敲除，建立自噬缺陷小鼠系，研究自噬對小

4、鼠免疫功能的影響，尤其是對CD4+和CD8+T細胞的影響。為什么自噬功能缺陷會導致T細胞更容易活化，免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)容易被打破，我們更知之甚少。為了弄清楚這個問題，我們構(gòu)建了CD4+T細胞條件性Beclin1基因敲除小鼠。嘗試理清楚在 T細胞的自噬功能缺陷時，具體哪些信號通路受到影響，哪些信號通路這這個過程中起到關鍵作用。
　　目的:通過Beclin1敲除，建立自噬缺陷小鼠系，研究自噬對小鼠免疫功能的影響，尤其是對T細胞的影響；以及

5、在CD4+T細胞中敲除Beclin1基因，研究自噬是通過哪些信號影響T細胞活性。
　　方法:從自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠中提取淋巴結(jié)和脾臟的淋巴細胞，以及從結(jié)腸分離結(jié)腸固有層淋巴細胞，使用熒光標記抗體 anti-CD4、anti-CD8、anti-CD44、anti-CD122、anti-CD45、anti-CD62L、anti-CD11b、anti-Gr1標記細胞表面蛋白，通過細胞流式分析小鼠CD4+ T細胞和CD8+T細胞、效

6、應T細胞、記憶T細胞、幼稚型T細胞、MDSC、等。
　　使用熒光標記抗體anti-IL-17、anti-IFN-γ、anti-Ki67、anti-foxp3檢測細胞內(nèi)相關蛋白的水平，分析T細胞IL17、IFN-γ的分泌水平，以及T細胞增殖能力，以及Treg情況。
　　從自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠淋巴結(jié)和脾臟中分離 CD4+T，體外培養(yǎng)，anti-CD3和anti-CD28的刺激一段時間，Western blot檢測i-κB、

7、p-ERK、P-P38、P-ZAP70水平，流式細胞術檢測p-S6的水平，通過MitoSOX?Red Mitochondrial Superoxide Indicator檢測線粒體氧化水平，通過Elisa檢測上清中的IL2。自噬缺陷小鼠以及野生型小鼠淋巴結(jié)和脾臟中分離淋巴細胞，用 Indo-1AM作為熒光指示劑，流式細胞術檢測細胞的鈣通道流量。
　　小鼠脾臟淋巴結(jié)中分離CD4+T細胞的細胞，體外培養(yǎng)，anti-CD3和anti-C

8、D28的刺激加自噬抑制劑E64-D和Pepstatin A，抑制4小時和24小時。收集裂解細胞，western blot檢測P62的水平。
　　結(jié)果:阻斷自噬導致小鼠體重下降，脫肛以及結(jié)腸腫大；幼稚型CD4+T細胞減少；效應CD4+T細胞增多；CD122和CD44雙陽性的細胞相對于野生型，在CD4+或者CD8+T細胞中的比例都顯著提高；Beclin1基因缺陷小鼠中CD4+T細胞和CD8+T細胞在脾臟和淋巴結(jié)以及腸系膜淋巴結(jié)中都顯著

9、減少；基因缺陷小鼠相對正常的野生型小鼠中性粒 MDSC和單核細胞 MDSC都顯著的增多；CD4+或者CD8+T分泌IFN-γ以及IL-17的水平顯著增強。
　　在小鼠結(jié)腸中，自噬功能缺陷時，CD4+T細胞或者CD8+T細胞分泌IFN-γ以及IL-17的水平顯著提高；Treg細胞在CD4+T細胞中的比例增多；CD4+T細胞、CD8+T細胞的增殖水平比較高。
　　經(jīng)過TCR信號的活化，Beclin1基因缺失的CD4+T細胞相對于

10、正常T細胞，P-P38的水平明顯降低；mTOR信號增強；線粒體氧化水平增強；IL2分泌水平降低；鈣通道流量減弱。抑制CD4+T細胞的自噬功能P62表達上調(diào)。
　　結(jié)論:我們的實驗結(jié)果提示自噬功能缺陷，導致 T細胞更容易活化，增殖能力提高，效應T細胞比例增加，分泌IFN-γ和IL-17的水平顯著提高。但是CD4+T和 CD8+T細胞并沒有增多，說明自噬還影響了T細胞的存活。而MDSC以及Treg增加說明機體對T細胞的過度活化提升了免