濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)硅藻技術(shù)的建立及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的:溺死(drowning)是由于液體機(jī)械性地阻塞呼吸道及肺泡，阻礙氣體交換，使機(jī)體缺氧，二氧化碳潴留，導(dǎo)致其窒息死亡。我國(guó)沿海、沿江地區(qū)溺死的案件相對(duì)較多，水中尸體檢驗(yàn)是法醫(yī)工作中的重要內(nèi)容。實(shí)際檢案中，水中尸體死因多為溺死，但存在拋尸入水偽裝成溺死的可能，因此水中尸體可能與刑事案件相關(guān)，必須進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定。溺水尸體可呈現(xiàn)出特有的病理征象，如口、鼻部蕈樣泡沫，水性肺氣腫，支氣管內(nèi)異物等。然而對(duì)于一些溺死病理不典型的尸體或是高度腐敗的

2、尸體，由于各種病理征象已不復(fù)存在，常需借助其它檢驗(yàn)技術(shù)輔助鑒定溺死。溺死的輔助診斷方法有很多，但其或缺乏特異性，或受尸體腐敗等因素的影響，或者理論、技術(shù)不成熟等，使這些方法難以應(yīng)用于法醫(yī)溺死診斷。溺水過(guò)程中，機(jī)體劇烈呼吸使溺液中的硅藻通過(guò)肺泡毛細(xì)血管屏障進(jìn)入血管，隨血液循環(huán)進(jìn)入全身各個(gè)臟器，加之硅藻分布廣泛和良好的抗酸性和耐腐蝕性使的硅藻檢驗(yàn)對(duì)輔助鑒定溺死具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
　　目前，硅藻檢驗(yàn)被認(rèn)為是水中尸體尤其是腐敗尸體溺死診斷較

3、為可靠的證據(jù)。法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)實(shí)踐中，主要由三個(gè)過(guò)程組成:消解、富集和觀察。法醫(yī)學(xué)者研究的硅藻檢驗(yàn)方法多只針對(duì)消解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，而忽略了將三個(gè)過(guò)程均進(jìn)行優(yōu)化，他們?cè)趯?shí)際應(yīng)用時(shí)存在一些問(wèn)題，如傳統(tǒng)的強(qiáng)酸消解法消解程序簡(jiǎn)單，成本低廉，但存在富集效率較低，靈敏度低的問(wèn)題;使用掃描電鏡觀察硅藻分辨率高，硅藻觀察清晰，種類鑒定容易，但其成本較高，使其應(yīng)用范圍受到限制。本課題旨在建立一種硅藻檢出率高、操作簡(jiǎn)單、安全，對(duì)設(shè)備要求不高，檢驗(yàn)成本低的硅藻檢

4、驗(yàn)方法，使其在硅藻檢驗(yàn)過(guò)程中獲得良好效果，并為基層法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供一種合適的硅藻檢驗(yàn)方法。
　　方法:方法建立:分別使用醇類、醛類、酸類、苯類、丁香酚、樹脂類等試劑與水系濾膜(聚醚砜(PES)材料）、有機(jī)系濾膜（尼龍材料）和核孔濾膜（有機(jī)化合物材料）相互反應(yīng)，探索建立一種基于濾膜富集和光學(xué)顯微鏡檢測(cè)臟器及水樣內(nèi)硅藻的新方法，并對(duì)該法的操作步驟進(jìn)行優(yōu)化。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):10只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射過(guò)量麻醉劑處死后提取腎臟待檢

5、;廣州市區(qū)段珠江水樣500ml。實(shí)驗(yàn)樣本隨機(jī)分為強(qiáng)酸消解-離心富集-光鏡檢驗(yàn)法組（A組）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯(lián)用法組（B組）、微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)法組（C組），每組20份樣本;三組樣本分別采用強(qiáng)酸消解-離心富集-光鏡檢驗(yàn)法（方法A）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯(lián)用法（方法B）微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)法（方法C）處理。觀察指標(biāo)為樣本前處理時(shí)間、組織消解程度、硅藻總回收率、各硅藻種類回收率、應(yīng)用效果。
　　尸體

6、樣本:收集2013年2月至2013年10月廣州市水中尸體56例，其中明確溺死的尸體30例、明確死因?yàn)樗篮髵伿胨氖w26例，并收集同時(shí)段廣州市區(qū)陸地死亡的尸體30例。取上述案例尸體的肺、肝、腎組織和對(duì)照水樣并分別采用強(qiáng)酸消解-離心富集-光鏡檢驗(yàn)法（方法A）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯(lián)用法（方法B）和微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)法（方法C）進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)。觀察指標(biāo)為硅藻檢出情況、樣本前處理時(shí)間、觀察效果和結(jié)果比對(duì)。
　　結(jié)果:方

7、法建立:經(jīng)使用7類試劑與3種濾膜交叉對(duì)比研究，結(jié)果顯示丁香酚—乙酸混合試劑滴加在水系濾膜上立即使濾膜變透明，可直接在光學(xué)顯微鏡下觀察，視野干凈，硅藻觀察清晰。同時(shí)，建立了一套新的硅藻檢驗(yàn)方法:微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)法。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:三種硅藻檢驗(yàn)方法處理2g兔腎組織所需的時(shí)間（不包括硅藻觀察），方法A處理時(shí)間最長(zhǎng)，方法B其次，方法C處理時(shí)間最短(P＜0.05)。方法A消解組織不完全，光鏡下可見較多組織碎塊，部分硅藻被碎塊

8、覆蓋，光鏡下計(jì)數(shù)和鑒定硅藻種類困難;方法B消解組織完全，無(wú)組織殘留，硅藻表面紋理清楚，易于計(jì)數(shù)和鑒定種類;方法C處理樣品后濾膜透光性好，滿足光鏡檢驗(yàn)要求，消解組織完全，無(wú)組織殘留，光鏡下可見硅藻散在密集分布，可觀察到硅藻表面紋理，光鏡下易于計(jì)數(shù)和鑒定硅藻種類。三種方法的硅藻總回收率分別是2.6±1.7％、76.9±20.2％和54.2±23.1％。方法B硅藻總回收率最高，方法C其次，方法C最低(P＜0.05)。A、B、C三組硅藻各種類的

9、回收率（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）分別是2.95±4.11％、65.54±29.66％和45.31±29.69％。方法A硅藻種類回收率最低，方法C其次，方法B硅藻種類回收率最高(P＜0.05)。
　　尸體樣本結(jié)果:方法A對(duì)溺死組肺中的硅藻種類為39.8±34.6％，硅藻數(shù)量為4936.3±9863個(gè)/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數(shù)量均低于方法B和方法C。方法B對(duì)溺死組肺中的硅藻種類為69.6±38.5％，硅藻數(shù)量為52743.5±82

10、018.8個(gè)/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數(shù)量最高。方法C對(duì)溺死組肺中的硅藻種類為39.8±34.6％，硅藻數(shù)量為4936.3±9863個(gè)/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數(shù)量高于方法A。方法A處理肺、肝、腎組織的時(shí)間較另兩種方法長(zhǎng)，方法B其次，方法C處理肺、肝、腎組織樣本的時(shí)間最短(P＜0.05)。方法A對(duì)肝、腎的觀察效果較差，硅藻檢出量少;方法B對(duì)肺、肝、腎組織最好，視野干凈，不影響硅藻觀察;方法C對(duì)肺臟和水樣的觀察效果

11、較方法B差，會(huì)有異物顆粒影響觀察。
　　結(jié)論:本課題建立了一種基于濾膜富集的光學(xué)顯微鏡觀察硅藻新技術(shù)。消解液中的硅藻富集至水系濾膜（聚醚砜材料）后，可與丁香酚-乙酸試劑相互作用，使濾膜能直接置于光學(xué)顯微鏡下觀察。將溺死尸體、死后入水尸體和陸地死亡尸體的樣本采用微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗(yàn)法進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)研究，并同時(shí)比較了其它兩種常用硅藻檢驗(yàn)方法。本方法在實(shí)際案例檢驗(yàn)過(guò)程中具有靈敏度高、能有效避免污染，且簡(jiǎn)單、高效、設(shè)備要求不高、易于