CKIP-1對(duì)小鼠股骨不同結(jié)構(gòu)影響的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
  骨質(zhì)疏松癥是目前公認(rèn)的一種常見(jiàn)的慢性、衰老相關(guān)性骨骼疾病。在我國(guó),影響著將近1億多人的身體健康和生活質(zhì)量,其涉及的人群廣、發(fā)病率高,但是治療效果并不令人十分滿意。同時(shí),骨質(zhì)疏松與口腔頜面外科、口腔種植、口腔修復(fù)以及牙周病等多個(gè)學(xué)科聯(lián)系密切。無(wú)論是骨質(zhì)疏松、骨折、口腔修復(fù)、種植等疾病的治療,對(duì)其骨量和骨質(zhì)都有一定的要求,如何更好的提高骨量同時(shí)能夠改善骨質(zhì)對(duì)于骨質(zhì)疏松等骨疾病的治療有重要的意義。近年來(lái)興起的基因治療為骨質(zhì)疏

2、松疾病的康復(fù)帶來(lái)了希望。同時(shí),越來(lái)越多的相關(guān)基因也被重視起來(lái),包括CKIP-1等基因。
  CKIP-1(Casein Kinase-2 Interaction Protein-1)近幾年被發(fā)現(xiàn)是骨形成的負(fù)調(diào)控基因。于2008年Nature Cell Biology報(bào)道CKIP-1基因敲除小鼠可以正常出生,其骨形成速率、骨量和骨礦密度顯著增高。但CKIP-1對(duì)骨組織不同結(jié)構(gòu)(松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨、軟骨)是如何影響的,尚未見(jiàn)報(bào)道。

3、  目的:
  本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CKIP-1基因敲除小鼠,對(duì)同窩同性別小鼠股骨進(jìn)行比較,通過(guò)Micro-CT掃描、組織學(xué)染色和免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)比觀察CKIP-1基因敲除小鼠與野生型小鼠股骨不同結(jié)構(gòu)(松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨、軟骨)之間影響的差異。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該基因在骨形成和骨質(zhì)疏松等骨疾病治療中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  方法:
  1、通過(guò)野生型(WT)與CKIP-1基因敲除(KO)小鼠飼養(yǎng)繁殖,在第12周分別對(duì)8對(duì)同窩雄性WT

4、和KO小鼠股骨的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨進(jìn)行Micro-CT三維掃描分析與H&E染色,比較兩組小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨量的差異。
  2、通過(guò)麗春紅三色染色,比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中膠原含量總量的差異;通過(guò)天狼猩紅染色,比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨I型膠原占總膠原含量的比例的差異。
  3、通過(guò)麗春紅三色染色,比較WT和KO小鼠股骨軟骨的差異。通過(guò)番紅O染色比較WT和KO小鼠股骨軟骨含量的差異。
  4、通

5、過(guò)甲苯胺藍(lán)染色,比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨新生骨骨量與成骨細(xì)胞數(shù)量的差異。通過(guò)四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記,比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨礦化沉積率(MAR)的差異。
  5、通過(guò)TRAP染色,比較WT和KO小鼠股骨生長(zhǎng)板(GP),松質(zhì)骨(TB)以及皮質(zhì)骨(CB)部位破骨細(xì)胞數(shù)量的差異。
  6、通過(guò)免疫組化染色,比較WT與KO小鼠股骨中CKIP-1、經(jīng)典WNT信號(hào)通路激活標(biāo)記物Axin2、成骨分化標(biāo)記蛋白C

6、OL I的分布及表達(dá)量的差異。
  結(jié)果:
  1、松質(zhì)骨Micro-CT結(jié)果分析顯示,KO組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)分別比WT組增加了3.9%、0.7(1/mm)、5.3×10-3(mm);骨表面積與骨體積比(BS/BV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)分別比WT組降低了24.4(1/mm)、0.04(mm)。皮質(zhì)骨Micro-CT結(jié)果分析顯示, KO組皮質(zhì)骨面積(Ct.Ar)

7、、皮質(zhì)骨內(nèi)徑周長(zhǎng)(Ct.Id.Pm)、皮質(zhì)骨外徑周長(zhǎng)(Ct.Od.Pm)、皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)、皮質(zhì)骨體積(Ct.BV)與WT組相比均無(wú)顯著性差異。H&E染色結(jié)果分析顯示,KO組骨小梁面積(Tb.Ar)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁寬度(Tb.Wi)分別比WT組增加了4.35%、0.7(1/mm)、5×10-3(mm);KO組骨小梁分離度(Tb.Sp)比WT組降低了0.06(mm);KO組皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)與WT組相比無(wú)顯著

8、性差異,HE染色結(jié)果與Micro-CT分析結(jié)果趨勢(shì)一致。
  2、松質(zhì)骨麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示,KO組膠原總量(Tb.Col.Ar)比WT組增加了3.7%;皮質(zhì)骨麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示,KO組膠原總量(Ct.Col.Ar)無(wú)顯著性差異。天狼猩紅染色結(jié)果分析顯示,KO組松質(zhì)骨中I型膠原占總膠原含量的比例(Tb.Col I)、皮質(zhì)骨中I型膠原占總膠原含量的比例(Ct.Col I)與WT組相比均無(wú)顯著性差異。
  3、軟骨

9、麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示,KO組軟骨含量與WT組相比呈下降趨勢(shì)。軟骨番紅O染色結(jié)果分析顯示,KO組軟骨含量(Cl.Ar)比WT組降低了0.04(mm2)。
  4、松質(zhì)骨甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果分析顯示,KO組的新生骨骨量與WT組相比呈增加趨勢(shì);KO組成骨細(xì)胞數(shù)量(Tb.Ob.N)比WT組增加了近一倍。皮質(zhì)骨甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果分析顯示,KO組成骨細(xì)胞數(shù)量(Ct.Ob.N)與WT組相比無(wú)顯著性差異。松質(zhì)骨四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記結(jié)果分析顯

10、示,KO組骨礦化沉積率(Tb.MAR)比WT組增加了1.7(μm/天)。皮質(zhì)骨四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記結(jié)果分析顯示,KO組骨礦化沉積率(Ct.MAR)與WT組相比無(wú)顯著性差異。
  5、TRAP染色結(jié)果分析顯示,生長(zhǎng)板、松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨部位的破骨細(xì)胞數(shù)量,在兩組之間未見(jiàn)顯著性差異。
  6、免疫組化染色結(jié)果分析顯示,KO組CKIP-1蛋白表達(dá)為陰性,WT組表達(dá)為陽(yáng)性。KO組松質(zhì)骨Axin2蛋白平均光密度值A(chǔ)xin2.Tb.M

11、OD比WT組增加了0.013;皮質(zhì)骨部位兩組表達(dá)均為陰性。KO組松質(zhì)骨COL I蛋白平均光密度值COL I.Tb.MOD比WT組增加了0.01,KO組皮質(zhì)骨COL I蛋白平均光密度值COL I.Ct.MOD與WT組相比無(wú)顯著性差異。
  結(jié)論:
  CKIP-1負(fù)調(diào)控骨質(zhì)骨量變化,可能是其表達(dá)降低后通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌膠原總量和加快軟骨骨化速率,從而促進(jìn)松質(zhì)骨的骨形成效果,而該基因不影響皮質(zhì)骨和破骨相關(guān)的骨吸收作用,為應(yīng)用該

12、基因治療OP選擇臨床適應(yīng)癥提供了理論依據(jù)。具體結(jié)論如下:
  1、CKIP-1基因可負(fù)調(diào)控松質(zhì)骨骨量的變化,而對(duì)皮質(zhì)骨骨量的變化幾乎無(wú)影響。
  2、CKIP-1基因可負(fù)調(diào)控松質(zhì)骨膠原總量,但對(duì)I型膠原占總膠原含量的比例的變化幾乎無(wú)影響。對(duì)皮質(zhì)骨膠原總量和I型膠原占總膠原含量的比例的變化幾乎無(wú)影響。
  3、CKIP-1基因可正調(diào)控軟骨骨量。猜測(cè):CKIP-1敲除后加快了軟骨骨化速率。
  4、CKIP-1基因可

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