醒腦靜對大鼠急性顱腦損傷后腦水腫的治療作用及機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的： 通過建立SD大鼠自由落體腦創(chuàng)傷模型，觀察腹腔注射XNJ對大鼠急性顱腦創(chuàng)傷后腦水腫、BBB的損害及AQP4的影響，探討其腦保護(hù)作用及作用機(jī)制。 研究方法： 1.實(shí)驗(yàn)動物 清潔級、健康、成熟SD雄性大鼠108只，體重300～350g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦外傷組和XNJ治療組。后兩組再分為傷后1、3、5、7d等4個亞組，每亞組12只。 2.實(shí)驗(yàn)方法 采用參照Feeney'S自由落體模

2、型設(shè)計并適當(dāng)改進(jìn)的打擊裝置。用20g重的擊錘從30cm高處自由墜落沖擊撞桿，沖擊力為600g·cm，造成腦挫裂傷，制作大鼠腦創(chuàng)傷模型。XNJ治療組在大鼠腦外傷模型做好后10min內(nèi)腹腔內(nèi)注射XNJ10mL·kg-1，每天一次。腦外傷組則腹腔內(nèi)給予等量0.9％氯化鈉溶液，假手術(shù)組僅行開顱術(shù)，不造成腦損傷。 3.標(biāo)本采集和檢測 3.1腦組織含水量檢測將大鼠傷后第1、3、5、7d分別斷頭處死后，立即取出傷側(cè)大鼠腦組織，110℃

3、恒溫箱烘烤24h至恒重。用干濕質(zhì)量法計算腦組織含水量。計算公式為：腦組織含水量(％)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100％。假手術(shù)組術(shù)后24h做同樣處理。 3.2BBB定量測定采用EB比色法。各組于處死前1h通過股靜脈注射2％EB(3mL·kg-1)。取腦組織前，快速開胸暴露心臟，迅速穿刺左心室后，剪右心房一小口，用37℃生理鹽水500mL灌注，至右心房流出清亮液體。取傷灶周邊腦組織約0.2g，加入5mL甲酰胺，45℃水浴24h

4、，1500r·min-1離心10min，取上清液用HP8453型分光光度計(λ=635nm)測其光密度值。用倍比稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得腦組織EB含量，結(jié)果以μg·g-1(腦組織)表示。 3.3AQP4免疫組化染色各組大鼠在預(yù)定時間點(diǎn)在傷灶區(qū)周圍取腦組織，4％甲醛固定24-48h，石蠟包埋，然后切片行HE染色和免疫組化檢查。以細(xì)胞膜呈棕黃色或褐色為AQP4陽性染色。應(yīng)用NIKON彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

5、 3.4腦組織AQP4mRNA的實(shí)時熒光RT-PCR測定分別取各組不同時間點(diǎn)的損傷周圍腦組織進(jìn)行RT-PCR分析，按Trizol試劑說明提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AQP4引物：上游5'GGTCCTCATCTCCCTCTGCTT3'，下游5'AACCGTGGTGACTCCCAATCC3'，擴(kuò)增片段長270bp；β-肌動蛋白引物：上游5'TGTGATGGTGGGTATGGG3'，下游

6、5'TAGAAGCATTTGCGGTGC3'，擴(kuò)增片段長度為241bp。反應(yīng)體系50uL，PCR條件：95℃預(yù)變性3min；再95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。求得各基因的Ct值。采用2-△△Ct方法，即以管家基因β-肌動蛋白的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化目的基因Ct值，得到各時點(diǎn)目的基因初始模板相對量，再計算各時點(diǎn)目的基因初始模板相對量與假手術(shù)組目的基因初始模板相對量的比值，分析各時點(diǎn)目的基因AQP4mRNA表達(dá)相對

7、量的變化。 4.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用單因素方差分析方法(One-WayANOVA)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 1.各組大鼠腦含水量比較 研究結(jié)果： 腦外傷組腦組織含水量傷后1d達(dá)高峰，并持續(xù)至第3d，第5d開始下降，第7天仍明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。XNJ組腦含水量也在第1d達(dá)高峰，后逐漸下降，但均明顯低于腦外

8、傷組(P<0.05)；并于第7d降至接近正常，與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P>0.05)。 2.各組大鼠腦組織EB含量比較 腦外傷組EB含量傷后1d達(dá)高峰，后逐漸下降，各時點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。XNJ組EB含量傷后1d達(dá)高峰，也逐漸下降，各時點(diǎn)均明顯低于腦外傷組(P<0.05)，但均不同程度高于假手術(shù)組。 3.腦含水量與EB的相關(guān)分析 腦含水量與EB的變化規(guī)律相同，相關(guān)分析得，r=0.89

9、8，P<0.01，表明二者具有正性相關(guān)。 4.AQP4免疫組化染色和AQP4mRNA 光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞膜呈棕黃色或褐色為AQP4陽性染色。腦外傷組傷后1dAQP4免疫染色變深，它的mRNA水平上調(diào)，并持續(xù)至第3d，明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；在第5d開始下降，與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P>0.05)。XNJ治療后1、3d的AQP4和AQP4mRNA較腦外傷組明顯上調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論：