呼吸道感染細菌聯(lián)合疫苗制備及免疫效果評價.pdf

1、目的：研制我國小兒常見呼吸道感染細菌聯(lián)合疫苗，分別對其進行體外實驗與動物體內(nèi)實驗研究。通過檢測免疫細胞增殖、細胞因子生成、細胞表型變化、小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、吞噬細胞功能和臟器指數(shù)等一系列特異性免疫功能及非特異性免疫功能的免疫學(xué)指標(biāo)，探討此聯(lián)合疫苗對機體免疫功能的影響，進一步確定其影響機體免疫系統(tǒng)的機制，為研制我國呼吸道感染細菌聯(lián)合疫苗提供理論依據(jù)。
　　方法：1、制備聯(lián)合疫苗分離培養(yǎng)我國小兒呼吸道感染常見6種細菌（溶血

2、性鏈球菌、流感嗜血桿菌 B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌），用生理鹽水洗細菌三次，然后超聲波破碎細菌，用飽和硫酸銨沉淀細菌蛋白，再通過透析膜去除硫酸銨，分光光度計測定蛋白含量，作為抗原。將抗原混合后用生理鹽水配置成一定濃度作為聯(lián)合疫苗。2、體外實驗1）用 CCK-8法檢測聯(lián)合疫苗對人淋巴細胞增殖活性的影響。2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測細胞因子白細胞介素-2（IL-2)和干擾素-γ（IFN-γ）含量；3

3、）流式細胞儀(FCM)檢測細胞表型變化。3、體內(nèi)實驗取 SPF級小鼠40只，隨機分成四組：正常對照組（NC），聯(lián)合疫苗1組，聯(lián)合疫苗2組，聯(lián)合疫苗3組，每組10只。全部實驗小鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，分別用濃度為0.1mg∕ml，0.2mg∕ml，0.4mg∕ml聯(lián)合疫苗免疫1組，2組，3組小鼠，每天上午灌服0.2ml。NC組小鼠每天灌服0.2ml生理鹽水。免疫10天。然后將小鼠處死，進行免疫學(xué)實驗檢測。1）測定聯(lián)合疫苗組小鼠

4、巨噬細胞吞噬功能。2）觀察聯(lián)合疫苗對小鼠細胞免疫功能（遲發(fā)型超敏反應(yīng)，DTH）的影響。3）檢測聯(lián)合疫苗組小鼠血清中溶血素含量的變化。4）觀察聯(lián)合疫苗對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響。
　　結(jié)果：1、人外周血淋巴細胞增殖活性檢測結(jié)果顯示：各濃度聯(lián)合疫苗組OD值均高于對照組，均對外周血淋巴細胞起增殖作用（P＜0.05），最佳濃度為50μg/ml。2、細胞因子 IFN-γ、IL-2檢測結(jié)果顯示：各濃度聯(lián)合疫苗組 IFN-γ、IL-2值均高

5、于對照組（P＜0.05，P＜0.01）。最佳濃度為50μg/ml，高于此濃度時，細胞因子含量開始降低。3、流式細胞儀檢測 CD3+細胞和CD19+細胞的結(jié)果顯示：聯(lián)合疫苗組CD3+細胞數(shù)與 CD19+細胞數(shù)均高于對照組（P＜0.01）。4、小鼠巨噬細胞吞噬功能檢測結(jié)果顯示：對照組巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)分別為22.5±1.95和0.32±0.20；聯(lián)合疫苗組均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。5、小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測結(jié)果顯示：聯(lián)合疫

6、苗組左右后足重量差分別為21.60±2.07mg、23.36±2.65mg、25.63±3.02mg，顯著高于正常對照組的16.50±2.12mg（P＜0.01）。6、血清溶血素含量結(jié)果顯示：對照組溶血素吸光度值為0.205±0.023，各濃度聯(lián)合疫苗組溶血素吸光度值分別為0.219±0.018，0.236±0.022，0.258±0.015，均高于對照組（P＜0.01）。7各濃度聯(lián)合疫苗組與對照組相比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增高（P