肝癌細胞外泌體的鑒定及蛋白質組學研究.pdf

1、目前，臨床上應用最廣泛的肝癌血清標志物是AFP，而AFP診斷肝癌具有局限性，因而亟待探索發(fā)現(xiàn)新的有價值而實用的標志物。2013年，James E. Rothman，Randy W. Schekman，Thomas C因發(fā)現(xiàn)細胞囊泡運輸?shù)恼{節(jié)機制，揭開細胞內的運輸機制之謎而榮獲了當年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。作為人體內一類重要囊泡，外泌體（exosomes）已成為生物標志物研究熱點。由于外泌體中含有的特有蛋白質、脂質、RNA、microRNA

2、等活性物質，在細胞通訊、細胞遷移等方面發(fā)揮重要作用。目前已從外泌體中發(fā)現(xiàn)多種生物標志物，如檢測外泌體中EGFR、MET、ALK和BRAF可作為肺癌標志物，這為肝癌生物標志物的研究提供了新思路。
　　由于蛋白質是生命功能的直接體現(xiàn)者，蛋白質組學在蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。對處于探索階段的外泌體研究來說，關于外

3、泌體蛋白質組學的研究目前還很少報道。為此，本研究探討適合肝癌細胞外泌體分離的新方案，通過改良超離法分離純化肝癌細胞SMMC-7721、正常肝細胞HL-7702、肝癌血清和正常對照血清的外泌體，并從形態(tài)學和特異蛋白等方面進行鑒定；利用LC-MS/MS質譜技術分析鑒定肝癌細胞及其外泌體主要蛋白，并進行相關功能分析，為肝癌細胞外泌體進一步研究提供研究基礎。
　　第一章改良超速離心法提取肝癌細胞外泌體及鑒定
　　目的：探索肝癌細胞和

4、血清外泌體的提取和鑒定方法，為外泌體的標志物的研究提供基礎。
　　方法：連續(xù)適應無血清培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細胞,收集細胞上清液,采用ExoQuick試劑法、ExoQuick試劑結合超濾法和改良超速離心法三種方法分離、純化培養(yǎng)上清液中肝癌細胞外泌體；ExoQuick試劑法和超速離心法提取血清外泌體；透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，Nanosight技術分析粒徑，Western blot分析外泌體特異蛋白Alix、CD63、CD9的表達

5、；利用SDS-PAGE電泳分析肝癌細胞和血清外泌體的蛋白譜。
　　結果：采用ExoQuick試劑法和ExoQuick試劑結合超濾法提取的外泌體濃度低、純度差；改良超速離心法可分離出純度高的外泌體，透射電鏡觀察肝癌細胞外泌體,外形呈圓形或橢圓形; Nanosight技術分析外泌體顆粒直徑峰值為122 nm,直徑30-150 nm之間顆粒占72.16％;Western blot證實在細胞培養(yǎng)上清液和外泌體提取液中均能檢測到Alix、C

6、D63、CD9的蛋白表達; SDS-PAGE電泳清晰顯示外泌體中高豐度大分子結構蛋白明顯少于肝癌細胞和血清。
　　結論：利用連續(xù)適應無血清細胞培養(yǎng)結合改良超速離心法能提取高純度的外泌體,肝癌細胞外泌體中高豐度大分子結構蛋白干擾少，有利于標志物的研究。
　　第二章肝癌細胞外泌體蛋白質組學研究
　　目的： LC-MS/MS質譜技術蛋白組學分析鑒定肝癌細胞SMMC-7721及其外泌體的主要蛋白，生物信息學分析其功能。

7、　　方法：分離和純化肝癌細胞SMMC-7721外泌體，通過LC-MS/MS質譜技術分析鑒定肝癌細胞SMMC-7721及其外泌體的主要蛋白，篩選共同表達蛋白；運用DAVID系統(tǒng)對共同表達蛋白進行GO分類分析和信號傳導通路分析；運用String系統(tǒng)對共同表達蛋白進行網(wǎng)絡蛋白相互作用分析。
　　結果：經(jīng)人類uniprot數(shù)據(jù)庫檢索鑒定，采用高置信度的肽段（大于95%），檢出肝癌SMMC-7721細胞蛋白4922個，SMMC-7721外泌

8、體蛋白1568個，兩者共同蛋白1035個，其中肽譜圖匹配數(shù)PSMs＞40的相對高表達蛋白70個；在70個蛋白中外泌體膜蛋白有4個，分別為肌球蛋白9（Myosin-9，MYH9），視黃酸誘導的蛋白3（Retinoic acid-induced protein3，GPRC5A），整合素β-1（Integrin beta-1，ITGB1），人源重組蛋白（Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase

9、2，GALNT2）；70個蛋白分類分析顯示，大部分蛋白屬于細胞器或膜蛋白類（31%）、結合類（60%）及轉移/載體蛋白類（28%）；對70個蛋白進行信號通路分析，富集出與肝癌有關重要信號傳導通路2條，分別為基因剪切通路（Spliceosome）和在癌癥通路（Pathways in cancer）； String分析70個蛋白相互作用，顯示功能節(jié)點蛋白為DHX9、PRKDC、HSP90AA1、ITGB1、AGRN、 RUVBL1、 EEF