禽白血病病毒B、E和J亞群基因芯片檢測方法的建立.pdf

1、近年來雞淋巴白血病(AL)一直危害著我國的養(yǎng)雞業(yè),已成為影響我國蛋雞業(yè)的第一大疫病。由于常規(guī)實驗室檢測方法費時費力,進口ELISA試劑盒價格高昂且準確率并不理想,所以急需一種快速、靈敏、準確、高通量的檢測方法來預防和控制AL發(fā)生和傳播。本研究基于多重PCR技術(shù),建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亞群的基因芯片分型和檢測方法。
　　 根據(jù)NCBI已收錄的ALV三個亞群的參考毒株cDNA序列,在各亞群特異性基因突變區(qū),兩端選取其

2、保守區(qū)域,設(shè)計合成三個亞群的通用上游引物1條,以及B、E亞群的通用下游引物和J亞群下游引物各l條,將上述引物用Cy3標記,建立多重PCR體系;參考目的序列內(nèi)部的三個亞群各自的保守區(qū)域,選擇亞群之間基因突變位點多的區(qū)域,設(shè)計5條寡核苷酸探針,合成過程中在每條探針的5'端先加入若干個堿基T,使探針長度達到35mer左右,再進行氨基化修飾,將合成好的探針點制在醛基化玻璃基片上,制作寡核苷酸探針基因檢測芯片;以寄主細胞DF-1中提取傳代ALV的

3、cDNA,以及合成NCBI收錄的各亞群參考毒株的cDNA序列作為檢測模板,利用Cy3標記的PCR擴增產(chǎn)物,與基因芯片進行雜交反應,掃描結(jié)果。對基因芯片進行特異性、靈敏度實驗,并對50份臨床樣品進行檢測。
　　 經(jīng)雜交反應后,芯片能夠準確檢測并分型三個亞群的參考毒株,其檢測靈敏度能夠達到102個基因拷貝,能夠同時檢測到三個亞群參考毒株的多重PCR產(chǎn)物,且與禽類常見的四種病毒均無交叉反應。對臨床樣品檢測的結(jié)果與ELISA抗體檢測結(jié)果