豆狀囊尾蚴絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)的克隆表達及酶活性研究.pdf

1、豆狀囊尾蚴病(Cysticercosis pisiformis)是由豆狀帶絳蟲（Taenia pisiformis）的幼蟲豆狀囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）寄生于兔的肝臟、大網(wǎng)膜、腸系膜及腹腔內引起的一種絳蟲病。豆狀囊尾蚴病是家兔感染率較高的常見寄生蟲病之一，對養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展和經(jīng)濟效益產(chǎn)生較大影響。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)是一類分子質量在40～50k

2、Da的蛋白酶抑制劑，不僅參與調節(jié)寄生蟲內源性生理功能，而且還在宿主-寄生蟲相互作用以及宿主的免疫調節(jié)或免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用。因此，serpin被認為是參與免疫調節(jié)和其他生物學過程的重要因子，有望作為寄生蟲病診斷、生物藥物及疫苗的候選靶標。本研究在系統(tǒng)分析豆狀囊尾蚴Cpserpin（Cysticercus pisiformis serpin，Cpserpin）基因及其表達特征的基礎上，探索了基于重組蛋白Cpserpin用于間接ELI

3、SA診斷豆狀囊尾蚴病的可行性，并以真核表達的Cpserpin評價了對絲氨酸蛋白酶的抑制效果，為揭示Cpserpin的生物學功能，闡明其在豆狀囊尾蚴感染中的作用提供了理論依據(jù)。
　　1.利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增(RACE)法獲得Cpserpin基因的全長cDNA序列，并對其進行生物信息學分析。結果表明，Cpserpin的eDNA序列全長1471bp，其完整開放閱讀框(ORF)長為1149bp，且具有serpin家族保守

4、基序(DEEGAE)、標簽序列(FKVDHPFIFFI)及特有的反應中心環(huán)結構域(RCL)等結構特征。
　　2.成功構建了重組表達質粒pET30a(+)-Cpserpin，經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌中表達了主要以包涵體形式存在的重組蛋白Cpserpin。Western-blotting檢測結果表明，Cpserpin可被兔豆狀囊尾蚴病陽性血清識別。通過優(yōu)化反應條件，以Cpserpin為包被抗原建立的間接ELISA方法對兔豆狀囊尾蚴病的

5、敏感性和特異性分別可達96.7％和93.5％，且批間和批內的變異系數(shù)均小于10％。表明Cpserpin有望作為豆狀囊尾蚴病診斷的候選抗原分子。
　　3.qPCR結果表明，Cpserpin在成熟節(jié)片中的轉錄水平較囊尾蚴階段提高了53倍。利用鎳珠瓊脂糖凝膠親和層析法純化的重組蛋白Cpserpin免疫新西蘭大白兔，經(jīng)3次免疫后，獲得了高滴度的特異性IgG抗體。免疫組化試驗結果顯示，Cpserpin在囊尾蚴階段表達量很低，但在成節(jié)和孕節(jié)中

6、高度表達，且廣泛分布于蟲體體壁和蟲卵中，推測可能與寄生蟲逃避宿主的免疫攻擊、及攝取營養(yǎng)和生殖發(fā)育有關。
　　4.成功構建了真核表達質粒pPIC9K-Cpserpin，在畢赤酵母KM71中進行誘導表達。SDS-PAGE和Western-blotting結果表明，重組蛋白Cpserpin不僅能與標簽抗體和兔豆狀囊尾蚴陽性血清反應，而且純度很高。用發(fā)色底物法分別檢測Cpserpin對α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶活性抑制效果的結果表