下一代測序技術在混合DNA分析中的應用研究.pdf

1、目的：盡管這些年對于混合DNA的分型研究取得了一些進展，但仍有諸多問題未得到有效解決，混合DNA分型依然是當前法醫(yī)遺傳學研究的難點。鑒于傳統(tǒng)毛細管電泳 STR分型技術的局限性，不能充分挖掘混合 DNA中蘊藏的遺傳信息。近幾年來,下一代測序技術（next generation sequencing, NGS）引起了法醫(yī)學者的極大興趣同時法醫(yī)學者也正致力于將其向法醫(yī)遺傳領域應用的轉化。下一代測序 STR分型技術較毛細管電泳具有極大的優(yōu)勢，它

2、既能觀察各 STR基因座的長度多態(tài)性信息，又能檢測到各基因座序列多態(tài)性信息，從中發(fā)掘出更多信息，這為混合DNA解釋提供了一個新的研究方向。因此，本研究擬采用Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel在Ion Torrent PGM平臺進行測序分析，分為系列實驗對其重復性、一致性、靈敏度進行實驗室內部評價，在此基礎上，利用NGS平臺對構建的兩男混合DNA樣本進行測序分析，對混合DNA主要參數進行評估并采用

3、本實驗室自主研發(fā)的sepDNA軟件進行分析，旨在為混合DNA解釋提供參考。
　　方法：
　　1.樣本采集：取自河北省血液中心50份無關健康男性個體抗凝血樣。3個標準品分別為9948 male DNA、2800 Control DNA和DNA Control007。
　　2.DNA提取：應用ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System試劑盒提取血樣DNA，采用NanoQ微型分光光度計進行全基因

4、組DNA純度檢測。
　　3.DNA定量：應用Quantifiler Human DNA Quantification Kit定量試劑盒對提取的全基因組DNA以及3個標準品采用7500 Real-time PCR System進行絕對定量。
　　4.樣本準備
　　4.1.實驗室評價部分：
　　以9948 Male DNA標準品構建文庫進行測序，平行實驗3次進行重復性研究；以取自河北省血液中心17份無關健康男性個體抗

5、凝血樣和3個標準品測序進行一致性研究；以9948 Male DNA標準品絕對定量結果制備系列起始DNA模板量(1 ng、500 pg、200 pg、100 pg、50 pg)進行測序，每個樣本平行實驗2次進行靈敏度研究。
　　4.2.混合DNA部分：
　　根據定量結果以 DNA濃度非常接近為歸類標準，將50個男性樣本的DNA定量結果進行歸類分組，選出其中符合標準的單一DNA樣本構建4組兩男混合DNA樣本，每組混合樣本設定4個

6、混合比率(1:1、1:4、1:9和1:19)。每個混合樣本平行實驗兩次。
　　5.文庫構建：應用 Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel和Precision ID Library Kit按照說明構建文庫。除外靈敏度研究中采用制備的起始DNA模板量外，其余樣本均稀釋至1 ng/μl，采用1 ng起始DNA模板量構建文庫。
　　6.模板制備：采用Ion PGM HiQ OT2 Kit在Ion

7、 OneTouch2 System儀器上按照說明制備測序模板。
　　7.Ion PGM測序：采用Ion PGM HiQ STR Sequencing Kit，在Ion PGM System按照手冊說明進行測序操作。
　　8.測序數據處理：測序結果采用 Ion Torrent Suite以及附帶的HID_STR_Genotyper和CoverageAnalysis進行分析。
　　9.CE-STR分型：所有單一樣本同時采用

8、PowerPlex Fusion System進行檢測分型，用于與NGS-STR分型的比較。
　　10.結果分析：首先對分析閾值確定等位基因和過濾 noise的效能進行評價。通過對樣本DoC、基因座平均DoC、基因座序列構成比以及ACR等參數的計算和統(tǒng)計分析對測序數據進行評價。在此基礎上對測序樣本的重復性、一致性和靈敏度進行統(tǒng)計分析，綜合評價在本實驗室的效能。利用NGS平臺對構建的兩男混合DNA樣本進行測序分析，對混合DNA主要參

9、數進行評估并采用本實驗室自主研發(fā)的sepDNA軟件進行分析。
　　結果：
　　1.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel的實驗室評價：
　　1.1.分析閾值
　　在默認分析閾值（即AT=5％）能過濾掉絕大多數noise序列達到較好的效能。
　　1.2.數據質量分析
　　數據質量參數經統(tǒng)計顯示，樣本平均DoC為2535×；基因座平均DoC為2542×；在基因座序列構

10、成比中，基因座%allele平均為90.83%，%stutter平均為4.22%，%noise平均為5.21%；STR基因座ACR平均為0.76，有2個基因座（D12S391和D12ATA63）平均ACR<0.6。
　　1.3.重復性研究
　　3.次重復間等位基因分型一致并且%Allele和ACR均無顯著性差異。
　　1.4.一致性研究
　　在CE-STR與NGS-STR可比較的761個等位基因中有758（99.

11、61%）個等位基因分型一致，兩者有3（0.39%）個等位基因在 D18S51出現不一致性分型。同時在 D2S441、D1S1656、D8S1179、D3S1358、vWA、D21S11、D2S1338和D12S391等8個基因座檢出同等位基因。
　　1.5.靈敏度研究
　　在默認分析閾值下，起始DNA模板量低至100 pg時等位基因仍可被完全檢出；起始DNA模板量為50 pg時等位基因發(fā)生較多的dropout，等位基因檢出率

12、為88.68%。不同起始 DNA模板量 ACR顯示，起始 DNA模板量低至100 pg，平均ACR為0.598，仍能得到較好的均衡性。隨著起始模板量的降低，平均 ACR從0.729降至0.329，CV從23.95%增至98.21%。
　　2.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel對混合DNA分型的研究：
　　混合DNA研究中8個單一樣本構建4組混合樣本，每組混合樣本設置4個不同混合比率，

13、總共含有16個混合樣本，每個混合樣本平行實驗2次。計算每個樣本平均等位基因檢出個數時按照四舍五入取整數的方式進行等位基因計數。
　　2.1.等位基因的序列信息進行同等位基因的區(qū)分
　　NGS-STR可以檢測等位基因的序列差異進行同等位基因的區(qū)分。例如，觀察到在混合比率1:9，vWA基因座次要組分（14，17）和主要組分（17，18）共享等位基因17。利用序列差異，次要組分等位基因17能夠從主要組分等位基因中得到區(qū)分；D1S1

14、656基因座次要組分(11,14)的等位基因11與主要組分（12，15）等位基因12的n-1 stutter重疊，利用序列差異可以將兩者進行區(qū)分。
　　2.2.各混合比率樣本基因座平均DoC
　　在混合比率為1:1時，基因座平均DoC最低為451±130×（FGA），最高為7263±2105×（Amelogenin）。在混合比率為1:4時，基因座平均DoC最低為698±222×（FGA），最高為10636±3520×（TPO

15、X）。在混合比率為1:9時，基因座平均DoC最低為565±223×（D3S4529），最高為9249±1640×（TPOX）。在混合比率為1:19時，基因座平均 DoC最低為563±214×（D3S4529），最高為10571±2176×（TPOX）。
　　2.3.不同混合比率等位基因檢出情況
　　在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時，默認分析閾值下每個混合比率總的等位基因檢出數目分別為365、354、309和28

16、1個，分別有0、0、7和15個等位基因丟失，等位基因檢出率分別為100%，96.98%、84.66%和76.99%。在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時，每個混合比率的次要組分未共享等位基因分別共檢出134、134、130和121個，在默認分析閾值下分別共檢出134、124、78和49個，檢出率分別為100%、92.54%、60.00%和40.50%。
　　2.4.混合DNA主要參數評估
　　2.4.1.混合DNA

17、雜合型均衡比（Hb）
　　混合樣本主要組分平均 Hb在每個混合比率展現了較好的均衡性，在4個混合比率中平均Hb最小值為0.70，最大值為0.78。在混合比率為1:1和1:4時，次要組分平均Hb分別為0.73和0.67，均呈現出較好的均衡性；在混合比率為1:9和1:19時，Hb呈現較大變異甚至發(fā)生雜合性丟失，平均Hb分別為0.54和0.45。
　　2.4.2.D值和實測混合比例（Mx1）分析
　　Mx分析中基因座D值分布

18、顯示所有基因座絕大部分數據位于D值＜0.2且基因座DoC＜4000×的區(qū)間內，其中82%的基因座D值＜0.1，93%的基因座D值＜0.15。除1:1外，其余混合比率絕對部分D值均＜0.1?；旌媳嚷蕿?:1時，4個樣本Mx1最小值為0.47，最大值為0.49；混合比率為1:4時，4個樣本Mx1最小值為0.16，最大值為0.19；混合比率為1:9時，4個樣本Mx1最小值為0.08，最大值為0.12；混合比率為1:19時，4個樣本 Mx1最小

19、值為0.05，最大值為0.07。混合比率從1:1降低至1:19時，變異系數從27.21%增至54.19%。
　　2.5.sepDNA軟件分析—分離準確率
　　2.5.1.整體分離準確率
　　在最優(yōu)基因型，Bayes和Iter數學模型的分離準確率分別為64.91%；和64.28%；兩者分離準確率沒有顯著性差異（P=0.7734）。在考慮備選基因型后，Bayes和Iter數學模型的分離準確率分別為74.18%和71.13%

20、，兩者分離準確率沒有顯著性差異（P=0.1353）。
　　2.5.2.不同混合比率分離準確率
　　在最優(yōu)基因分型時，Bayes數學模型在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準確率分別為52.15%、75.76%、72.40%和65.05%；Iter數學模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準確率分別為50.14%、75.36%、72.39%和65.07%。在考慮備選基因型分型后，Bayes數學模型在1:1、1:4、

21、1:9和1:19的分離準確率分別為65.17%、84.87%、81.73%和73.20%；Iter數學模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準確率分別為58.82%、83.74%、79.10%和68.08%。
　　2.5.3.等位基因共享對分離準確率的影響
　　Bayes數學模型進行分析，在最優(yōu)基因型時，有共享基因座的分離準確率為60.00%，未共享基因座的分離準確率為71.83%，兩者存在顯著性差異（P=0.000

22、2）；在考慮備選基因型后，有共享基因座的分離準確率為70.81%，未共享基因座的分離準確率為78.93%，兩者存在顯著性差異（P=0.0048），提示在兩種情形下未共享基因座的分離準確率均顯著高于共享基因座。Iter數學模型進行分析，在最優(yōu)基因型時，有共享基因座的分離準確率為59.64%，未共享基因座的分離準確率為70.81%，兩者存在顯著性差異（P=0.0004）；在考慮備選基因型分型后，有共享基因座的分離準確率為66.67%，未共享

23、基因座的分離準確率為77.41%，兩者存在顯著性差異（P=0.0003），提示在兩種情形下未共享基因座的分離準確率顯著高于共享基因座。
　　結論：
　　1.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel結合Ion Torrent PGM平臺在本實驗室展現了良好的表現可以成功地應用于STR分析。
　　2.應用NGS技術進行混合DNA的STR分型，較CE-STR分型技術可獲得更多有價值的信息如