低氧調控細胞因子分泌及糖代謝的作用與機制.pdf

1、低氧是任何一種生理性氧量不足或組織需氧量不足的狀態(tài)。由于大氣壓的降低引起的缺氧稱為低壓性低氧（hypobaric hypoxia），高原低氧屬于低壓性低氧。而多種疾病如心肺功能衰竭、腫瘤等病理生理過程也與低氧密切相關[1]。機體對低氧的反應和適應是一個多層次和機制復雜的調控過程。在組織器官水平表現(xiàn)在造血系統(tǒng)的激活或紅細胞增加，以及呼吸系統(tǒng)功能改變等。而久居高原的人們在長期進化過程中機體形成了一系列適應低氧環(huán)境的生理機制。細胞水平的改變包

2、括細胞形態(tài)結構、特征以及生物學特性生長改變。細胞生長因子分泌和細胞代謝改變是多種細胞低氧反應的共同特征，受基因組、轉錄和表觀遺傳改變等多層次環(huán)節(jié)的調控。
　　不同細胞類型對低氧反應的程度和特點不同。造血系統(tǒng)是由造血微環(huán)境和造血細胞組成，是對低氧反應最敏感的系統(tǒng)之一。骨髓微環(huán)境分泌多種細胞因子調節(jié)造血細胞的粘附、遷移，歸巢和增殖分化。一般認為造血微環(huán)境保持一種低氧狀態(tài)。骨髓間充質干細胞是骨髓微環(huán)境的重要細胞組成部分，也是研究細胞低氧

3、反應的理想模型。
　　細胞對低氧適應的調節(jié)中，特異性 miRNAs可調控大量編碼蛋白基因的表達并發(fā)揮重要調控作用。多種重要的miRNAs通過調控HIFs參與低氧適應的調節(jié)，導致血管生長因子的表達變化從而影響細胞的生物學特性。miR-17-92基因簇含有的6個miRNA,包括miR-17、miR-18、MiR-19a、miR-19b、miR20和miR-92的基因腫瘤miRNA簇。它在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，可通過調控內皮細胞的增殖

4、和遷移發(fā)揮促血管新生的作用。但其是否參與低氧調控及機制并不清楚。細胞線粒體是受低氧影響最敏感的細胞器之一。Ptpmt1是位于細胞線粒體上的線粒體蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員，參與能量代謝，被證明與心磷脂合成有關。考慮到Ptpmt1在細胞中能量代謝和磷脂類物質代謝中的重要性，闡明它與低氧的關系及其它信號的關聯(lián)性將具有重要意義。SPK是合成 S1P并維持細胞內脂類代謝產物平衡的重要限速酶，也是細胞代謝的重要細胞信號分子。SPK低氧調節(jié)并參與促

5、血管新生。低氧能夠激活多條細胞存活相關的信號通路，如PI3/AKT、Sirt1、MAPK等，而SPK和這些信號通路存在很廣泛的關聯(lián)性。SPK又是一個低氧誘導的反應分子，其介導 SPK/S1P信號通路無疑在低氧導致的異常能量代謝過程中發(fā)揮重要的調控作用。闡明其和SPK調控Ptpmt1的信號對糖代謝作用的影響及協(xié)同作用，將更深入闡釋細胞低氧反應的機制。
　　本課題利用間充質干細胞和紅系白血病細胞系TF-1為模型，從miRNA和細胞信號

6、水平，研究了低氧調控細胞因子分泌及糖代謝的作用與機制。闡明了miR-17-92在低氧誘導BM-MSCs細胞因子分泌的作用；證明了線粒體酪氨酸磷酸化酶1（Ptpmt1）是一個低氧誘導的線粒體能量代謝相關分子；并證明了磷酸鞘氨醇信號和Ptpmt1參與細胞增殖、存活及能量代謝的調節(jié)。
　　一、miRNA17-92調控低氧誘導BM-MSCs分泌血管生長因子
　　BM-MSCs能夠分泌的各種細胞因子，包括HGF、VEGF和ANG-1等

7、。已知低氧預處理能夠提高BM-MSCs分泌血管生長因子的能力，并提高BM-MSCs治療缺血性疾病的效果。但是，低氧誘導血管生長因子分泌的作用和機制還不清楚。特異性的microRNA是低氧誘導細胞生物學反應的重要的調控環(huán)節(jié)。miRNA-17-92是與腫瘤發(fā)生和血管新生密切相關的microRNA簇。我們利用PCR、ELISA和基因轉移等方法闡明了miR-17在BM-MSCs分泌血管生長因子中調控作用與機制。
　　實驗利用貼壁培養(yǎng)方法，

8、培養(yǎng)、鑒定并擴增了 BM-MSCs。BM-MSCs具有成脂和成骨分化的能力，表達CD73、CD90、CD105等間質分子，不表達CD11b、CD34、CD45等造血細胞的表面抗原。BM-MSC具有向成脂和成軟骨分化的能力。低氧1％ O2處理能夠誘導BM-MSCs表達VEGF、HGF和ANG-1等血管生長因子，同時Hif-1α的表達水平也明顯提高。與此同時，miR-17-92的表達檢測結果表明，miR-17和 miR-18經低氧刺激后的表

9、達水平明顯降低。轉染miR-17的抑制劑能夠促進BM-MSCs分泌上述的血管生長因子，提示miR-17表達減低參與BM-MSCs分泌血管生長因子調控。慢病毒介導miR-17-92高表達能夠增強BM-MSCs的增殖能力，但低氧狀態(tài)下，其促增殖能力明顯低于常氧狀態(tài)。我們研究結果提示miR-17是低氧誘導血管生長因子分泌的負調控分子。
　　Hif-1α是介導低氧誘導細胞促血管活性物質分泌的主要轉錄調節(jié)因子。利用生物信息學分析表明Hif-

10、1α3′-UTR存在miR-17的結合序列。我們構建了miR-17的結合序列Hif-1α3′-UTR報告基因載體，利用熒光素酶報告實驗證明了Hif-1α是miR-17的靶基因。miR-17模擬物轉染BM-MSCs可抑制其Hif-1α的表達。從而證明了低氧下調miR-17表達，導致靶基因Hif-1α上調促進血管生長因子分泌的新機制。
　　二、SPK及Ptpmt1參與低氧導致糖代謝變化
　　低氧可引起人類和動物的細胞代謝失衡，包

11、括線粒體功能障礙與氧化應激。然而，缺氧導致線粒體功能障礙和能量代謝失衡的機制仍不清楚。細胞膜磷脂代謝衍生物神經酰胺(ceramide,Cer)、鞘氨醇(sphingosine,Sp)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate,S1P)在調控細胞增殖、存活及能量代謝過程中發(fā)揮重要調控作用，其中S1P也是重要的促血管生成信號分子。鞘氨醇激酶（SPK）是細胞內合成S1P并調控細胞內Cer、SP、S1P代謝平衡的一種關鍵酶。線

12、粒體酪氨酸磷酸化酶1（Ptpmt1）是線粒體特異的酪氨酸磷酸酶。我們利用人紅白血病細胞系（TF-1）研究了SPK信號通路及Ptpmt1在低氧所致糖代謝紊亂中的作用，并探討了SPK信號和Ptpmt1的關聯(lián)性。
　　低氧培養(yǎng)或化學模擬低氧試劑（DFO）處理TF-1細胞都能夠誘導Hif-1α、Hif-2α、SPK和Ptpmt1的上調。證明了SPK及Ptpmt1都是低氧誘導表達的分子。利用慢病毒介導Hif-1αshRNA、Hif-2α s

13、hRNA轉染，建立了HIF-1α和HIF-2α沉默TF-1細胞系。確定了只有沉默Hif-2α shRNA才能降低Ptpmt1的表達，表明Ptpmt1是Hif-2α的下游分子。為闡明SPK信號和Ptpmt1在低氧誘導促進生成血管生長因子和能量代謝中的作用。我們構建了攜帶 SPK-shRNA、Ptpmt1-shRNA慢病毒載體并制備了慢病毒，感染TF-1細胞后能夠有效干涉SPK和Ptpmt1的表達。利用RT-PCR和蛋白印跡技術證實了干涉效

14、率。通過CCK-8測定細胞增殖活力，通過流式細胞儀檢測 AnnexinV和 PI雙標記確定細胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)SPK-shRNA和Ptpmt1-shRNA轉染能夠明顯抑制細胞的增殖并且誘導細胞的凋亡。研究結果表明SPK和Ptpmt1是維持細胞增殖和存活的重要磷酸酶。我們進一步觀察了敲低SPK和Ptpmt1表達的TF-1細胞的葡萄糖代謝的情況。SPK和Ptpmt1敲低能夠明顯減低細胞葡萄糖的利用和消耗。糖轉運分子是細胞糖代謝的協(xié)同分子，我們

15、利用RT-qPCR的方法發(fā)現(xiàn)Ptpmt1受抑制可以減少Glut1和 Glut3的表達，從而降低TF-1細胞葡萄糖的消耗。更有意義的是，通過JC1染色確定了Ptpmt1基因敲低可導致線粒體功能障礙。為確定SPK信號和Ptpmt1之間的相關性，我們利用慢病毒轉導shRNA或SPK抑制劑DMS抑制TF-1細胞SPK活性。SPK抑制能夠提高Ptpmt1的表達，表明這兩個信號分子在細胞內存在相互作用和競爭性抑制關系。我們研究結果說明低氧上調 SP