慢性缺血缺氧在前列腺增生發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、研究目的:BPH是老年男性常見病與多發(fā)病,嚴重影響老年男性患者生活質量,病因未明。近年來越來越多研究提示BPH與下尿路慢性缺血改變存在著密切關系,下尿路慢性缺血可能是BPH病因之一。本研究旨在進一步探討局部缺血缺氧在BPH發(fā)病機制中的作用,冀希望通過本研究達到以下目的:
　　 1、通過臨床流行病學研究深化血管損害因素與BPH之間關系；精確測量前列腺組織內血流情況并通過橫向與縱向比較進一步驗證BPH局部組織缺血情況；
　　

2、 2、制造下尿路缺血兔模型,觀察前列腺缺血后改變；聯合下尿路缺血及BOO兩種因素觀察膀胱改變情況；
　　 3、觀察缺氧條件下前列腺間質及上皮細胞增殖與凋亡變化情況,進一步研究缺氧條件下間質及上皮細胞生長因子分泌及受體表達的變化。
　　 研究方法:
　　 1、收集我科經治BPH患者血管損害相關因素(高血壓、糖尿病、吸煙、高血脂、年齡)及前列腺癥狀資料(前列腺體積、IPSS評分、前列腺梗阻程度),采用多等級資料Log

3、istic回歸分析進行分析。
　　 經直腸CDUS檢測56例BPH患者及12例年輕志愿者前列腺移行帶血管阻力指數及血流灌注量,比較兩組之間前列腺移行帶血管阻力指數及血流灌注量之間差異,并就BPH患者兩側前列腺移行帶體積之間差異與其血管阻力指數及血流灌注量之間差異進行相關分析。
　　 2、40只成年新西蘭兔隨機分為5組,每組8只,其中4只采用半縫扎腹主動脈方法制造前列腺組織缺血模型,剩余4只為假手術對照。于術后第1,2,4

4、,8,12周各取1組觀察前列腺重量,并將前列腺組織石蠟切片HE染色后觀察鏡下改變,Ki67染色觀察前列腺組織內上皮細胞和間質細胞增殖情況,原位末端標記法檢測前列腺組織內上皮細胞和間質細胞凋亡情況。
　　 另取32只成年新西蘭兔隨機分為2組,其中兩組每組16只,一組制造膀胱出口梗阻模型,另一組制造缺血合并梗阻模型。結合前組假手術對照及單純缺血組,于術后第1,2,4,8周各取1組測量膀胱濕重,膀胱全層石蠟切片MASON染色觀察粘膜層

5、、粘膜下層、肌層及漿膜層厚度并分析膀胱間質平滑肌與膠原成分含量變化,S-100染色分析組織內神經原變化情況。檢測膀胱肌層組織中肌漿網鈣-ATP酶與檸檬酸鹽合酶活性。
　　 3、前列腺上皮細胞株RWPE-1及間質細胞株WPMY-1購自美國ATCC,培養(yǎng)傳代2代細胞性狀穩(wěn)定后,細胞以1×104、5×104、1×105/ml濃度,每孔100μl接種于72孔板,MTS法描記細胞生長曲線。
　　 上皮細胞混懸液以5×106/ml細

6、胞濃度接種于6孔板,每孔3ml。分別置于缺氧及有氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)4、8、12、24、48小時后收獲細胞,用RT-qPCR法檢測細胞HIF-1α、AR、ER、EGFR-1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R、EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1mRNA表達；ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1含量；制備細胞爬片,用免疫細胞化學法檢測細胞上AR、ER

7、、EGFR-1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R蛋白表達情況；間質細胞以3×106/孔接種6孔板,實驗方法同前。
　　 75cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)上皮細胞貼壁80～90％,棄上清液,加入間質細胞基礎培養(yǎng)基20ml/瓶,分別于有氧和缺氧條件下培養(yǎng)24小時,收集上清液離心去除細胞殘渣保存。有氧條件下制備為間質有氧條件培養(yǎng)基,無氧條件下制備為間質無氧條件培養(yǎng)基。比較在12、24和48小時間質在有氧條件培養(yǎng)基、無氧

8、條件培養(yǎng)基以及基礎培養(yǎng)基環(huán)境中分別置于有氧及缺氧條件下培養(yǎng),細胞增殖與凋亡之間差異。
　　 研究結果:
　　 1、單因素資料分析,在病變程度不同的各組間比較,隨高危因素程度或病例百分率增加,BPH病變程度增加。多因素資料采用分級變量Logistic分析顯示2型糖尿病在前列腺大小、IPSS評分及梗阻程度中均為最顯著的獨立相關因素(OR分別為3.179,3.862,2.847,P均<0.001),血清甘油三脂在前列腺大小、I

9、PSS評分及梗阻程度中均非顯著的相關獨立因素(P均>0.05),年齡、高血壓、高血脂和吸煙均是上述BPH病變程度顯著相關獨立因素。
　　 BPH患者前列腺移行帶血管阻力指數平均為0.84,高于年輕志愿者(0.55),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；而BPH患者移行帶血流灌注量低于年輕志愿者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；BPH患者兩側移行帶體積差異與兩側移行帶血管阻力指數之間差異呈正相關(r=0.713,P=0.001

10、)；與兩側移行帶血流灌注量呈負相關(r=-0.534,P=0.004)。年輕志愿者兩側前列腺移行帶體積、血管阻力指數及血流灌注量之間無統(tǒng)計學差異；
　　 2、缺血4周后兔前列腺重量為1.754±0.563g,8周后為2.836±0.517g,12周后為4.551±0.622g,均高于同期假手術對照組,差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。缺血1周后前列腺間質細胞Ki67染色開始增加,同時凋亡細胞數下降,與同期假手術對照組比較差異

11、均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。前列腺上皮細胞在缺血2周Ki67染色開始增加且凋亡細胞數下降。缺血合并BOO組膀胱重量較同期單純BOO組減少,差異均有統(tǒng)計學意義。缺血合并BOO組間質成分于術后即開始顯著增加,前2周平滑肌成分亦有顯著增加并達峰值。而單純BOO組術后前4周主要表現為膀胱平滑肌代償增加并達峰值,間質成分于第4周開始顯著增加。S-100染色神經元標志提示單純梗阻組于術后2周開始出現斑片狀去神經支配區(qū)域,且神經染色強度隨時間延長

12、而顯著降低,單純缺血組于術后第1周即出現去斑片狀去神經支配區(qū)域,但隨后神經染色強度并無顯著差異。而缺血合并BOO組于術后第一周即開始出現斑片狀去神經支配區(qū)域,神經染色強度隨時間延長而顯著減低。對照組無此病理變化。單純缺血組SERCA與檸檬酸合酶表達均呈逐漸下降趨勢,但術后第二周始下降程度減輕。而單純BOO組術后第一周即顯著下降,術后第二、第四周上升,至第八周再次出現顯著下降。缺血合并BOO組術后第一周顯著下降,第二周升至峰值后隨時間變化

13、顯著下降。
　　 3、缺氧培養(yǎng)前列腺上皮、間質細胞RT-qPCR顯示其HIF-1α、AR、ER、EGFR—1、VEGFR-1、TGF—βR1、bFGFR-1、IGF-1R、EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1 mRNA表達均隨時間增加而增加,有氧條件下培養(yǎng)HIF-1α基因未檢測到表達,上述基因表達與同期缺氧條件下比較均存在統(tǒng)計學差異。
　　 免疫細胞化學染色顯示前列腺上皮細胞與間質細胞AR、ER、EGFR-

14、1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R在無氧條件下培養(yǎng)較同期有氧條件下培養(yǎng)均顯著增加。
　　 ELISA顯示無氧條件下培養(yǎng)上皮細胞分泌TGF-β增加,而間質細胞分泌EGF、VEGF、TGF-β、bFGF均顯著增加。
　　 同時間段前列腺上皮細胞在無氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境中細胞增殖最高,凋亡細胞數最低,其后依次為有氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境、無氧條件培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)環(huán)境、有氧條件培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)環(huán)境,

15、而在基礎培養(yǎng)基中,無論培養(yǎng)環(huán)境有氧無氧,細胞增殖不明顯。
　　 同時間段前列腺間質細胞在有氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境中細胞增殖最高,凋亡細胞數最低,其后依次為無氧條件培養(yǎng)基無氧環(huán)境、基礎培養(yǎng)基無氧環(huán)境、無氧條件培養(yǎng)基有氧環(huán)境、有氧條件培養(yǎng)有氧環(huán)境、基礎培養(yǎng)基有氧環(huán)境(細胞增殖不明顯)。
　　 研究結論:
　　 1、BPH病變程度與血管損害因素之間存在相關性,且BPH患者前列腺移行帶存在缺血性改變,其缺血性改變程度與

16、前列腺移行帶體積明確相關。
　　 2、缺血可促進前列腺組織內間質及上皮細胞增殖,抑制其凋亡并最終導致前列腺重量增加,且這些變化與缺血時間相關；缺血首先引起前列腺組織內間質細胞發(fā)生改變。缺血可加重梗阻情況下膀胱逼尿肌功能損害,同時降低膀胱逼尿肌功能代償能力,加速膀胱組織內神經元損害過程。
　　 3、缺氧可誘導前列腺間質及上皮細胞內生長因子受體及雌雄激素受體的表達,促進前列腺間質細胞分泌多種生長因子。缺氧條件培養(yǎng)基和缺氧環(huán)境