一種新型轉(zhuǎn)錄因子MrkH的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌是一種常見的醫(yī)院感染條件致病菌，它可以在醫(yī)用器材表面形成生物膜來抵抗多種抗生素。生物膜的形成受多種因素的調(diào)節(jié)，在微生物細胞從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬顟B(tài)時一個非常重要的指標就是胞內(nèi)重要的第二信使分子3′，5′-環(huán)二鳥嘌呤核苷酸（c-di-GMP）水平的升高。甘露糖抗性的克雷伯氏菌狀(Mrk)血凝素或“Mrk蛋白”是肺炎克雷伯氏菌形成生物膜的關(guān)鍵因子。它是由mrkABCDF操縱子來編碼的，這些基因編碼組成克雷伯氏菌的三型菌毛-該

2、型菌毛在克雷伯氏菌生物膜形成過程中起著重要作用。菌毛還可以幫助細菌病原體附著在宿主細胞上來完成感染，已知的克雷伯氏菌中含有一型和三型兩種菌毛。MrkA是主要的菌毛菌絲亞單位，它們不斷堆積構(gòu)成了螺旋菌毛軸，MrkB和MrkC作為周質(zhì)空間分子伴侶分別將MrkA和MrkD轉(zhuǎn)運至外部菌毛的菌絲處，MrkD形成菌絲的粘附末端。三型菌毛還可以調(diào)節(jié)菌體附著胞外基質(zhì)蛋白，例如5型膠原以及肺上皮細胞基底膜區(qū)域。
　　近來的研究表明mrk基因簇編碼的

3、三型菌毛的表達是受一種c-di-GMP水平依賴的轉(zhuǎn)錄因子-MrkH調(diào)控的。MrkH作為一種新穎的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，c-di-GMP可以直接調(diào)控它的轉(zhuǎn)錄活性進而影響生物膜形成的相關(guān)基因的表達。MrkH有兩個結(jié)構(gòu)域組成:一個N端的YcgR-N類似結(jié)構(gòu)域和一個C端的PilZ結(jié)構(gòu)域。PilZ結(jié)構(gòu)域是一個經(jīng)典的c-di-GMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而YcgR-N結(jié)構(gòu)域的功能依舊不清楚。據(jù)我們所知，MrkH是第一個被發(fā)現(xiàn)包含PilZ結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白。但是關(guān)

4、于它如何識別DNA序列的依舊有很多爭議。2011年Wilksch等人首先發(fā)現(xiàn)MrkH是一個c-di-GMP依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并通過后續(xù)的研究定位了MrkH結(jié)合mrkA以及自身mrkHI轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的DNA結(jié)合序列。但最近StevenC legg課題組研究發(fā)現(xiàn)MrkH和MrkI一起可以更高效地調(diào)控三型菌毛的表達。MrkI是一個經(jīng)典的DNA結(jié)合蛋白，并且mrkI基因緊接著mrkH,并且mrkHI共轉(zhuǎn)錄。所以它是否直接參與MrkH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

5、還不是很清楚。本文我們想通過獲得MrkH，MrkH/c-di-GMP以及MrkH和DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來研究MrkH結(jié)合DNA的方式，同時我們還綜合運用生物化學(xué)、分子生物學(xué)及微生物學(xué)的多種實驗方法結(jié)合來揭示MrkH單獨或者與MrkI一起結(jié)合DNA并調(diào)控三型菌毛表達這一過程的分子機制。
　　本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　(1)利用蛋白質(zhì)晶體X射線衍射法解析得到了2.3(A)分辨率的克雷伯氏菌轉(zhuǎn)錄因子MrkH蛋白結(jié)合c

6、-di-GMP的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。將MrkH/c-di-GMP結(jié)構(gòu)與其他PilZ蛋白結(jié)構(gòu)進行對比發(fā)現(xiàn)它們在折疊類型上很相似，但是結(jié)構(gòu)細節(jié)有較大的差別，尤其是在PilZ結(jié)構(gòu)域。MrkH蛋白主要以單體形式存在，并且它的PilZ域有許多堿性蛋白富集區(qū)，很可能會結(jié)合一些負電荷分子，比如DNA分子。
　　(2)通過MrkH/c-di-GMP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的仔細分析，發(fā)現(xiàn)了c-di-GMP小分子與MrkH蛋白之間的結(jié)合方式。并利用等溫滴定量熱法驗證了M

7、rkH的保守氨基酸對c-di-GMP結(jié)合的具體貢獻。
　　(3)利用體外凝膠電泳遷移實驗分析并定位了MrkH蛋白結(jié)合DNA的主要結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MrkH的PilZ結(jié)構(gòu)域可以獨自結(jié)合DNA分子，并且具有獨特地結(jié)合DNA的方式:一條長鏈DNA分子可以不斷地結(jié)合PilZ蛋白分子。由此推斷MrkH蛋白結(jié)合DNA可能是非特異性的。在加入特異性的MrkH DNA盒子后，我們又獲得了一種MrkH/c-di-GMP復(fù)合物，我們通過結(jié)合之前獲得的結(jié)構(gòu)進

8、行比較發(fā)現(xiàn)MrkH在DNA存在下結(jié)合c-di-GMP后，其c-di-GMP結(jié)合的loop會更加彎曲，使得其YcgR-N和PilZ結(jié)構(gòu)域相對位置更加靠近。
　　(4)通過對MrkH的結(jié)構(gòu)分析，找到了位于蛋白質(zhì)表面可能與DNA結(jié)合有關(guān)的正電荷密集的區(qū)域。并通過定點突變的方法，克隆并純化得到了多種MrkH的突變體。EMSA實驗證明突變體蛋白都喪失或減弱了DNA結(jié)合的活性。同時利用熒光偏振的方法計算了各種MrkH突變體結(jié)合DNA的結(jié)合常數(shù)

9、，進一步驗證了MrkH主要通過其表面的正電荷區(qū)域結(jié)合非特異性的DNA序列，這些與DNA結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸大部分位于其PilZ結(jié)構(gòu)域。我們還嘗試利用最新的冷凍電鏡技術(shù)來解析MrkH與DNA的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過許多努力，我們沒能獲得質(zhì)量很好的單顆粒，這也驗證了MrkH結(jié)合DNA的復(fù)雜性。
　　(5)MrkH和一個包含HTH結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白MrkI一起共轉(zhuǎn)錄，我們猜想MrkH會和MrkI一起調(diào)控克雷伯氏菌的菌毛表達。因為MrkI蛋白的表

10、達一直不成功，我們通過MBP融合蛋白來獲得MrkI，經(jīng)過體外pull down實驗，我們驗證了MrkI可以和MrkH形成復(fù)合物，并且MrkH主要通過它的N端結(jié)構(gòu)域和MrkI結(jié)合。MrkI也可以結(jié)合mrkABCDF基因簇和它自己的啟動子調(diào)控序列，這表明MrkI可能發(fā)揮特異性的DNA識別功能。
　　根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們提出了MrkHI自我調(diào)控和調(diào)控細菌三型菌毛合成分子機制:一種可能是MrkHI形成復(fù)合體后一起識別結(jié)合MrkHI和mr

11、k基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，MrkI主要發(fā)揮特異性識別DNA的功能，這期間MrkH可能會輔助MrkI結(jié)合DNA并且c-di-GMP結(jié)合MrkH造成了MrkH兩端結(jié)構(gòu)域的相對位置改變，造成了MrkHI結(jié)合DNA的構(gòu)象改變，使得轉(zhuǎn)錄調(diào)控更加高效。也有可能還存在著另一種未知蛋白X，它會和MrkHI形成三元復(fù)合物，并主要由X來特異性識別DNA。而c-di-GMP也主要是通過對MrkH的構(gòu)象調(diào)整進而影響三元復(fù)合物結(jié)合DNA的能力。
　　MrkH

12、的PilZ結(jié)構(gòu)域只有120多個氨基酸，但它不但可以結(jié)合c-di-GMP小分子，同時具有結(jié)合DNA的能力。這表明PilZ結(jié)構(gòu)域還有許多我們未發(fā)現(xiàn)的功能。MrkI是一個典型的LuxR-型轉(zhuǎn)錄因子，具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但它的表達一直不夠完善。我們首次發(fā)現(xiàn)PilZ結(jié)構(gòu)域也是一種新的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。但是它結(jié)合DNA的模型還不夠清楚，我們可以確定PilZ域在體外結(jié)合非特異性的DNA，但體內(nèi)c-di-GMP的濃度變化是否影響其DN