rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)是常見(jiàn)的臨床病理生理過(guò)程，是肝切除術(shù)、肝移植、肝外傷、失血性和心源性休克等疾病共同經(jīng)歷的一個(gè)多因素參與的過(guò)程。HIRI是術(shù)后肝功能異常、原發(fā)性肝移植無(wú)功能、肝功能衰竭的重要原因。研究表明，HIRI是影響肝移植術(shù)后移植物長(zhǎng)期存活的危險(xiǎn)因素。如何干預(yù)HIRI導(dǎo)致的肝功能損害以及保護(hù)肝臟功能，愈來(lái)愈受到全球重視。探索防治HIRI的藥物已成為

2、當(dāng)前研究熱點(diǎn)。
　　 為了減輕肝臟缺血再灌注損傷，許多學(xué)者做了大量的研究，如縮短缺血時(shí)間、缺血預(yù)處理、缺血后處理及藥物處理等，從而達(dá)到減輕肝細(xì)胞損傷的目的。藥物處理是針對(duì)缺血再灌注的某個(gè)或某些機(jī)制利用藥物的藥理作用，減少再灌注損傷過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基、鈣超載、炎性介質(zhì)等或利用某些活性物質(zhì)直接或間接的藥理作用來(lái)增強(qiáng)肝組織或肝細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的耐受能力，減輕組織或細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到保護(hù)的作用。促紅細(xì)胞生成素（erythropo

3、ietin, EPO）由髓質(zhì)與腎皮質(zhì)交界處的球旁細(xì)胞合成的，能刺激骨髓造血的唾液糖蛋白類激素，促進(jìn)紅細(xì)胞的生成是其基本作用。
　　 EPO可通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、實(shí)體腫瘤、子宮等多種非紅系組織細(xì)胞表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin recptor, EPOR)結(jié)合，形成EPO-EPOR信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與多種非造血生物活動(dòng)，并對(duì)細(xì)胞和組織器官有保護(hù)作用。
　　 在肝臟疾病的治療過(guò)程中，使用重組人

4、紅細(xì)胞生成素(recombinant humanerythropoietin, rHuEPO)治療小鼠和大鼠，能夠顯著降低缺血再灌注所致?lián)p傷，包括肝臟組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)、酶學(xué)指標(biāo)、細(xì)胞凋亡、有害細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和活性氧作用。研究表明，rHuEPO體內(nèi)對(duì)缺血再灌注和其他原因引起的肝損傷保護(hù)，并不是直接作用于肝細(xì)胞，推測(cè)rHuEPO可能直接或間接地作用于非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和kupffer細(xì)胞等減輕肝臟損傷。因此，值得深入探討rHuEPO對(duì)

5、肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。
　　 本文采用大鼠自體肝移植動(dòng)物模型，模擬肝移植過(guò)程中肝臟經(jīng)歷缺血再灌注損傷的過(guò)程，通過(guò)研究血清中肝臟酶學(xué)指標(biāo)的變化，肝臟病理形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞凋亡等，觀察rHuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。并結(jié)合調(diào)控細(xì)胞存活的關(guān)鍵信號(hào)通路-磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)信號(hào)通路的變化，探討rHuEPO的作用機(jī)制，為研究rHuEPO預(yù)處

6、理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第一部分、大鼠自體肝移植模型的建立情況
　　 目的：肝移植動(dòng)物模型是肝移植實(shí)驗(yàn)研究的非常重要的基礎(chǔ)。Kamada提出的“雙套袖法”大鼠肝移植是目前應(yīng)用較廣泛且成熟的肝移植動(dòng)物模型，但此模型不吻合肝動(dòng)脈。而本中心建立的大鼠自體肝移植動(dòng)物模型，能模擬臨床肝移植過(guò)程，完全排除免疫、血管吻合等因素，全面反映肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程?，F(xiàn)總結(jié)該動(dòng)物模型建立情況以及術(shù)中、術(shù)

7、后管理經(jīng)驗(yàn)，以期該模型成功率高、重復(fù)性好。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)純系、雄性的SD大鼠55只，其中27只大鼠用于早期動(dòng)物模型建立訓(xùn)練。另28只大鼠按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求和藥物預(yù)處理的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中假手術(shù)組(sham)3只，其余各組I/R，I/R+rHuEPO，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO+LY294002，I/R+LY294002組，每組5只大鼠。
　　 2.手術(shù)操作經(jīng)術(shù)前準(zhǔn)備后，充分

8、游離肝周結(jié)構(gòu)，在使肝臟肝素化(含肝素37.5 U/ml)后，使用4℃含肝素（12.5 U/ml）的復(fù)方乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈、腹主動(dòng)脈雙重恒壓冷灌注。除冷灌注保存以及血管吻合操作外，其余方法同大鼠原位肝移植。
　　 3.觀察時(shí)間及內(nèi)容SD大鼠的觀察的時(shí)間點(diǎn)分別為24 h，48 h，72 h，觀察大鼠的生存質(zhì)量和存活情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法運(yùn)用SPSS13.0軟件繪制生存曲線。
　　 結(jié)果：
　　 1.以肝

9、素化大鼠時(shí)阻斷門靜脈到開(kāi)始冷灌注為熱缺血時(shí)間，到門靜脈開(kāi)放為無(wú)肝期。為標(biāo)準(zhǔn)化研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中熱缺血時(shí)間為2.5-3.5min、冷灌注時(shí)間均統(tǒng)一為15min。將無(wú)肝期時(shí)間設(shè)定為30 min。
　　 2.在實(shí)驗(yàn)初期，大鼠存活滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求達(dá)到92.31％。在研究實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)大鼠72 h生存率影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用LY294002(PI3K特異性抑制劑)預(yù)處理組的存活率低。
　　 小結(jié)：
　　 自體移植的動(dòng)物模型完全符合實(shí)

10、驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。手術(shù)操作時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本原則，注意小細(xì)節(jié)處理，能顯著改善大鼠術(shù)后恢復(fù)過(guò)程，甚至可以直接影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活。
　　 第二部分、rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 目的：建立的自體肝移植缺血再灌注損傷模型，從血清中肝臟酶學(xué)指標(biāo)變化、肝臟病理形態(tài)改變和肝細(xì)胞凋亡三方面，初步探討rHuEPO對(duì)大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.建

11、立自體肝移植的動(dòng)物模型（同第一部分）。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠隨機(jī)60只，分成3組:①GroupⅠ:假手術(shù)組(Sham)20只。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)象僅游離肝臟不給藥。②GroupⅡ:缺血再灌注組(I/R)20只。術(shù)前30 min經(jīng)尾靜脈給予1ml0.9％生理鹽水(normal saline，NS)。③GroupⅢ:rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)20只。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)象行自體原位肝移植手術(shù)。在術(shù)前30min，經(jīng)尾靜脈給予按

12、照體重（Kg）×3000 U/kg的rHuEPO并將混合在0.9％NS中，容積為1ml。除Sham組外，所有大鼠行自體肝移植手術(shù)，均經(jīng)歷15min冷灌注時(shí)間，30 min的無(wú)肝期。
　　 3.標(biāo)本的采集和處理按照肝臟再灌注后3h，6h，12h，24 h各時(shí)點(diǎn)每次處死5只大鼠。從IVC穿刺采集血標(biāo)本4ml后注入血生化管中，室溫血液自然凝固后離心，取上層血清標(biāo)本凍存于-20℃?zhèn)溆?。切取大鼠肝中葉部分作為標(biāo)本檢測(cè)，分別置液氮凍存和10

13、％中性甲醛固定備用。
　　 4.觀察指標(biāo)血清酶學(xué)變化，病理形態(tài)學(xué)改變以及細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(yàn)(LSD-t)，若方差不齊，采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.血清酶學(xué)指標(biāo)變化血清標(biāo)本在再灌注

14、后3h，6h，12 h及24 h各時(shí)間點(diǎn)取材，比較同一時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST及LDH水平差異。在同一時(shí)間點(diǎn)，各組動(dòng)物血清中AST水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（未標(biāo)明具體數(shù)據(jù)）。但是血清ALT、LDH的變化差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠經(jīng)自體肝移植手術(shù)后，I/R組和rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)的血清ALT、LDH水平均較假手術(shù)組(Sham)顯著升高(P＜0.01)。I/R+rHuEPO組同I/R組比較，血清中ALT、

15、LDH水平均顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后，血清ALT、LDH水平在再灌注后3h內(nèi)迅速上升，于再灌注后6 h噠到較高水平后呈下降趨勢(shì)，但至再灌注后24 h為止，血清中ALT、LDH水平均未恢復(fù)至正常水平，同Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.組織形態(tài)學(xué)變化選取再灌注6h后的肝臟標(biāo)本，作為觀察對(duì)象。HE染色結(jié)果提示:假手術(shù)組(Sham)大鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝

16、竇排列整齊，未見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。大鼠經(jīng)歷缺血再灌注損傷后6h，I/R組肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞邊界不清，肝小葉中央靜脈和肝血竇淤血明顯，肝血竇狹窄，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞可見(jiàn)不同程度的水腫變性和空泡狀變性，偶可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死，肝組織中有明顯中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤(rùn)，以中央靜脈周圍為甚。同Sham組比較，I/R組病理形態(tài)學(xué)評(píng)分高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是，經(jīng)rHuEPO預(yù)處理的肝臟(I/R+rHuEPO)組織，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小

17、葉中央靜脈、肝細(xì)胞索、肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞變性不明顯，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。
　　 3.肝細(xì)胞凋亡情況TUNEL法檢測(cè)提示:肝臟缺血再灌注時(shí)組大鼠肝臟可見(jiàn)凋亡細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果表明:缺血再灌注組(I/R)和I/R+rHuPO預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較Sham組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);I/R+rHuPO預(yù)處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著低于I/R組(P＜0.05);Sham組偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 小結(jié)：

18、>　　 本部分以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，運(yùn)用大鼠自體肝移植模型模擬肝臟缺血再灌注損傷。通過(guò)檢測(cè)血清酶學(xué)指標(biāo)、組織病理學(xué)及細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化證實(shí)了該模型能夠反應(yīng)缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。rHuEPO預(yù)處理能夠降低血清酶學(xué)指標(biāo)，改善肝臟組織形態(tài)，具有減輕缺血再灌注導(dǎo)致的損傷，對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　 第三部分、PI3K/AKT信號(hào)通路在rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用
　　 目

19、的：在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)擬利用大鼠自體肝移植的模型及PI3K特異性抑制劑LY294002，通過(guò)檢測(cè)血清酶學(xué)指標(biāo)的變化，肝臟病理形態(tài)改變和AKT蛋白的激活情況，探討PI3K/AKT信號(hào)通路是否參與rHuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.自體肝移植動(dòng)物模型的建立（同第一部分）。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物①GroupⅠ: Sham組;②GroupⅡ:缺血再灌注組(I/R);③Gro

20、upⅢ: rHuEPO預(yù)處理組（I/R+rHuEPO），上述三組第二部分實(shí)驗(yàn)已完成，本部分一并納入分析。本部分實(shí)驗(yàn)采用60只SD大鼠，隨機(jī)分入下列組別:④GroupⅣ: I/R+DMSO組(20只)，術(shù)前30 min，經(jīng)尾靜脈給予1ml2％(v/v)DMSO;⑤GroupⅤ: I/R+LY294002組（20只），術(shù)前60 min，按照1 mg/kg的LY294002將其溶解于1ml2％(v/v) DMSO中經(jīng)尾靜脈給藥;⑥GroupⅥ

21、:I/R+rHuEPO+LY294002組(20只)，術(shù)前60 min，按照1 mg/kg的LY294002將其溶解于0.5 ml2％(v/v) DMSO中經(jīng)尾靜脈給藥，術(shù)前30 min再按照體重(Kg)×3000U/kg rHuEPO并將混合在0.5ml的0.9％ NS中，經(jīng)尾靜脈再次給藥。上述各組動(dòng)物，均行自體肝移植手術(shù)。
　　 3.標(biāo)本的采集和保存（同第二部分實(shí)驗(yàn)）。
　　 4.觀察血清酶學(xué)的指標(biāo)檢查，肝臟組織形態(tài)

22、學(xué)評(píng)分（同第二部分實(shí)驗(yàn)）。
　　 5.Western Blot檢測(cè)rHuEPO和LY294002單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)處理對(duì)總AKT和磷酸化AKTSer473蛋白表達(dá)的影響。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析方法（同第二部分實(shí)驗(yàn)）。
　　 結(jié)果：
　　 1.PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理組對(duì)肝臟酶學(xué)指標(biāo)的影響在肝臟再灌注（無(wú)肝期結(jié)束開(kāi)始計(jì)時(shí)）3h，6h，12 h及24 h各時(shí)間點(diǎn)，I/R組，I/R+LY2940002

23、組，Sham組，I/R+DMSO血清ALT、LDH水平均有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。自體肝移植大鼠在經(jīng)歷缺血再灌注損傷后，其血清中ALT、LDH均較Sham組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中I/R+DMSO組同I/組比較，結(jié)果顯示兩組SD大鼠在經(jīng)歷肝臟缺血再灌注損傷后，其血清中ALT、LDH的變化均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。但是I/R+LY294002組，血清ALT、LDH水平在肝臟再灌注后上述時(shí)間

24、點(diǎn)較I/組和I/R+DMSO組均顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，I/R+LY294002組SD大鼠經(jīng)歷缺血再灌注后，血清ALT、LDH水平在再灌注后3h內(nèi)迅速上升，其后上升趨勢(shì)變緩，血清ALT、LDH水平于再灌注后6 h噠到較高水平后逐漸下降，但至再灌注24 h為止，血清ALT、LDH水平均未恢復(fù)至正常水平，同Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.藥物預(yù)處理對(duì)肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響為了進(jìn)

25、一步觀察PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注的作用，我們對(duì)復(fù)灌后6h各組大鼠肝臟的組織形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行量化比較。再灌注后6h，在I/R+DMSO組，肝細(xì)胞腫脹，肝竇內(nèi)淤血及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。LY294002預(yù)處理組(I/R+LY294002)大鼠病理學(xué)檢查可見(jiàn)肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)明顯破壞、大量的肝細(xì)胞變性、溶解，其病理?yè)p傷評(píng)分較高。在灌注后6h，同I/R+DMSO組，I/R+LY294002+rHuEPO組比較，I/R+LY294

26、002組組織病理學(xué)評(píng)分高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但LY294002+rHuEPO聯(lián)合預(yù)處理的SD大鼠，灌注結(jié)束后6h，少量壞死肝細(xì)胞形態(tài)不可辨別，細(xì)胞崩解、壞死，細(xì)胞核分解。綜合分析實(shí)驗(yàn)各組(Sham、I/R、I/R+DMSO、I/R+LY29400、I/R+rHuEPO、I/R+LY294002+rHuEPO)的組織病理學(xué)染色結(jié)果:在肝臟灌注結(jié)束后6h，使用LY294002預(yù)處理，反而加重了肝臟缺血再灌注后肝臟組織結(jié)構(gòu)的破壞，而聯(lián)合使用

27、rHuEPO預(yù)處理后，肝臟病理?yè)p傷有所減輕。rHuEPO預(yù)處理組病理?yè)p傷評(píng)分低，提示其對(duì)肝臟的組織形態(tài)有保護(hù)作用。
　　 3.rHuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注損傷的影響在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，將rHuEPO和LY294002聯(lián)合使用對(duì)自體肝移植大鼠進(jìn)行預(yù)處理。研究發(fā)現(xiàn)在再灌注后同一時(shí)點(diǎn)，I/R+rHuEPO+LY294002組同I/R+rHuEPO組比較，血清ALT、LDH水平顯著升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

28、5)。但是IR+rHuEPO+LY294002組與I/R+LY294002組比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清ALT、LDH水平在HuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理組有所降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.藥物預(yù)處理對(duì)總AKT和磷酸化AKTser473蛋白表達(dá)的影響以相應(yīng)蛋白條帶平均光強(qiáng)度值來(lái)表示AKT和p-AKT活化水平的相對(duì)強(qiáng)度。通過(guò)p-AKT ser473/β-actin和AKT/β-actin平均光強(qiáng)度值的比值，反映

29、PI3K/AKT信號(hào)通路的活化情況。肝臟灌注結(jié)束后6h，Sham、I/R、I/R+DMSO、I/R+LY29400、I/R+rHuEPO、I/R+LY294002+rHuEPO，各組總AKT表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是各組磷酸化AKTser473和總AKT(p-AKTser473/AKT)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)肝臟經(jīng)歷缺血再灌注損傷后，p-AKTser473磷酸化水平增高，同sham組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

30、與I/R組比較，rHuEPO預(yù)處理組磷酸化AKTser473的增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LY294002預(yù)處理組同I/R組比較，其磷酸化的AKTser473水平，顯著降低，提示LY294002預(yù)處理能夠抑制缺血再灌注以及rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)肝組織中的磷酸化AKTser473蛋白增高。
　　 小結(jié)：
　　 1.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)磷酸化AKT ser473表達(dá)增加與rHuEPO預(yù)處理引起

31、的組織病理學(xué)損傷，肝臟酶學(xué)的釋放顯著減少相一致。
　　 2.P13K阻斷劑LY294002顯著抑制了rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)磷酸化AKTser473表達(dá)的增加和對(duì)肝臟的保護(hù)。rHuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理，能減輕LY294002預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注的損傷。
　　 3.進(jìn)一步支持P13K/AKT信號(hào)通路的激活介導(dǎo)了rHuEPO預(yù)處理的肝臟保護(hù)作用。肝臟組織中磷酸化AKTser473、總AKT的蛋白表達(dá)的變化證實(shí)了r

32、HuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用有PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路參與。
　　 第四部分、eNOS在rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷保護(hù)中的作用
　　 目的：本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝臟組織標(biāo)本中總eNOS、磷酸化eNOS Ser1177的蛋白表達(dá)，eNOS mRNA、EPOR mRNA的變化，以及血清中NO和ET-1含量變化，探討PI3K/AKT/eNOS細(xì)胞信號(hào)通路參與rHuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟缺血

33、再灌注損傷的保護(hù)的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.收集肝臟組織標(biāo)本和血清樣本（第二、三部分實(shí)驗(yàn)保存）。
　　 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)eNOS mRNA，EPOR mRNA表達(dá)。
　　 3.Western Blot檢測(cè)肝臟組織中總eNOS和p-eNOS Ser1177的蛋白表達(dá)。
　　 4.硝酸鹽還原酶法測(cè)定大鼠血清樣本中NO含量。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清樣本中ET-1

34、含量。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析方法（同第二部分實(shí)驗(yàn)）。
　　 結(jié)果：
　　 1.rHuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟組織中eNOS mRNA含量的影響肝臟再灌注后6h，與假手術(shù)組(Sham)比較，經(jīng)歷缺血再灌注損傷各組肝臟組織內(nèi)eNOS mRNA含量顯著增高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同其I/R，I/R+DMSO和I/R+LY294002組比較，I/R+rHuEPO預(yù)處理組肝臟組織內(nèi)eNOSmRNA含量顯著增高

35、，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但是肝臟組織內(nèi)eNOSmRNA含量在I/R+rHuEPO和I/R+LY294002+rHuEPO組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理對(duì)肝臟組織中EROPmRNA含量的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果提示:與假手術(shù)組(Sham)比較，缺血再灌注6h后的肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA均顯著升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示缺血再灌注能夠增加肝臟組織中EPOR

36、 mRNA含量。同各組缺血再灌注比較，rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)并不能增加肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA含量。使用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理亦不能增加或減少肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA含量。
　　 3.藥物預(yù)處理對(duì)總eNOS，磷酸化eNOS Ser1177蛋白表達(dá)的影響通過(guò)免疫印跡分析比較缺血再灌注6h后的肝臟組織中eNOS蛋白和p-eNOSSer1177的變化，以各組磷酸化eNOS Ser1177/β

37、-actin與總eNOS/β-actin的比值進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)各組間總eNOS蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。磷酸化eNOS Ser1177在假手術(shù)組(Sham)中有較少的表達(dá)。但同I/R組比較，在rHuEPO預(yù)處理組使肝臟磷酸化eNOS Ser1177增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但是在使用PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理，磷酸化eNOS Ser1177的表達(dá)并沒(méi)有增加。聯(lián)合使用rHuEPO和LY

38、294002預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，rHuEPO預(yù)處理能改善LY294002對(duì)p-eNOS Ser1177的抑制。p-eNOS Ser1177在缺血再灌注各組中的變化趨勢(shì)同AKT及磷酸化AKTser473的趨勢(shì)一致。rHuEPO預(yù)處理能夠激活肝臟組織中磷酸化的AKT ser473和eNOS Ser1177蛋白表達(dá)增加。
　　 4.rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠血清中NO含量的影響用硝酸酶還原法進(jìn)行檢查肝臟灌注后3h，6h，12h，24 h血清樣本

39、中NO含量的變化。與假手術(shù)組(Sham)比較，經(jīng)歷缺血再灌注各組血清內(nèi)NO含量減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn)，rHuEPO預(yù)處理組血清中NO含量顯著增加。I/R+LY294002組的血清NO含量顯著降低，同其他各組（Sham，I/R，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO）比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺血再灌注6h后，經(jīng)歷缺血再灌注的各組大鼠的血清NO含量較低。這一變化趨勢(shì)與肝臟酶學(xué)指標(biāo)的釋放，組織病理形態(tài)學(xué)的改

40、變相一致。隨著時(shí)間的推移，大鼠血清NO水平逐漸升高，rHuEPO預(yù)處理組的血清NO水平，在灌注24 h后，與假手術(shù)組的大鼠血清NO水平基本接近。
　　 5.rHuEPO預(yù)處理對(duì)大鼠血清中ET-1含量的影響用ELASA法進(jìn)行檢查肝臟灌注后3h，6h，12 h，24 h血清樣本中ET-1含量的變化。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注損傷組血清內(nèi)ET-1含量顯著增加（P＜0.05）。在同一時(shí)間點(diǎn)，rHuEPO預(yù)處理組降低了血清中ET-1含量。

41、I/R+LY294002組的血清ET-1含量顯著升高，同其他各組（Sham，I/R，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO）比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺血再灌注3h，經(jīng)歷缺血再灌注的各組大鼠的血清ET-1含量較高，隨著時(shí)間的推移，大鼠血清ET-1水平逐漸降低，rHuEPO預(yù)處理組的血清ET-1水平，再灌注24 h后，與假手術(shù)組血清ET-1水平基本接近。
　　 小結(jié)：
　　 1.rHuEPO預(yù)處理并不能增加肝臟組織內(nèi)EPO

42、R mRNA含量，但能增加肝臟組織內(nèi)eNOS mRNA含量。LY294002預(yù)處理組對(duì)EPOR mRNA含量無(wú)影響。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理增加肝臟組織p-eNOSser1177蛋白的表達(dá)，LY294002預(yù)處理組抑制了p-eNOSser1177蛋白的表達(dá)，與AKT及p-AKTser473的趨勢(shì)一致，提示PI3K/AKT/eNOS細(xì)胞信號(hào)通路參與了rHuEPO對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)。
　　 3.當(dāng)肝臟經(jīng)歷缺血再

43、灌注損傷后，其血清中NO和ET-1之間的平衡關(guān)系被破壞。rHuEPO預(yù)處理組能夠顯著增加血清NO的水平，調(diào)節(jié)血清中NO和ET-1間的平衡，證實(shí)了rHuEPO預(yù)處理通過(guò)激活p-eNOSser1177表達(dá)和增加NO的釋放，減輕肝臟缺血再灌注導(dǎo)致的損傷。
　　 結(jié)論：
　　 1.自體肝移植的動(dòng)物模型，能夠模擬肝缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后，血清酶學(xué)指標(biāo)(ALT、LDH)顯著升高，肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，

44、肝細(xì)胞有壞死和凋亡的發(fā)生。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理可顯著抑制肝臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致的血清中ALT、LDH水平的升高，改善肝臟組織形態(tài)學(xué)損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡，減輕肝臟的病理?yè)p傷。
　　 3.LY294002預(yù)處理顯著抑制了rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)p-AKTSer473表達(dá)的增加和對(duì)肝臟的保護(hù)。提示rHuEPO預(yù)處理可能通過(guò)激活PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 4.LY294