激活NLRP3與NOD2受體對THP-1炎癥因子表達的影響.pdf

1、目的:
　　 具有核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)的NOD樣受體(NOD-LikeReceptors，NLRs)是哺乳動物細胞內的一種重要的模式識別受體（PatternRecognitionreceptors，PRRs）。NLRs是一組具有信號轉導功能的胞質蛋白，廣泛參與機體的炎癥應答反應。NLRs家族包括5類成員，NODs、NALPs、ICE、CIITA、IPAF/NAIP。NLRP3和NOD2是NLRs的兩個重要成員，在炎癥

2、反應中起著關鍵的作用。ATP是NLRP3的特異性配體，當ATP刺激嗜中性粒細胞、巨噬細胞后可以引起NLRP3表達增強，活化后的NLRP3可導致半胱天冬酶(caspase-1)的自身激活，最后切割炎癥前體并引起IL-1β和IL-18分泌增多并排至胞外[1]。MDP是NOD2的特異性配體，MDP刺激單核細胞、巨噬細胞后可以引起NOD2活化，啟動經典NF-κB信號途徑，使無活性炎癥前體基因轉錄顯著增加，也可以通過NLRP1途徑激活caspas

3、e-1，這將為無活性炎癥前體的活化提供了一個反應平臺。目前關于激活NLRP3與NOD2受體對THP-1炎癥因子表達影響的報道較少。本實驗通過胞內識別受體的特異性配體MDP、ATP單獨與聯(lián)合刺激人單核細胞株(THP-1)，觀察細胞為NLRP3炎癥小體、caspase-1的mRNA表達情況及細胞上清液中IL-1β、IL-18炎癥因子表達的變化，探討激活NLRP3與NOD2受體對THP-1炎癥因子表達的影響。
　　 方法:
　　

4、 選取購自中科院上海生命科學研究院人單核細胞株(THP-1)進行藥物干預試驗。將4瓶狀態(tài)良好的THP-1經過細胞計數(shù)后各瓶均加入培養(yǎng)液至10ml。選定MDP藥物濃度為0.5μM，ATP藥物濃度為100μM，經過物質的量計算后10ml液體應加入所需藥物25μl，ATP256μl。實驗分為4組:空白對照組（加入PBS100μl后放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）;TMDP組（加入藥物濃度為0.5μM的MDP25μl，放入37℃CO2孵箱

5、恒溫孵育24h）;TATP組（加入藥物濃度為100μM的ATP256μl，放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）;TMDP+ATP組（加入藥物濃度為0.5μM的MDP25μl預刺激后放入37℃CO2孵箱恒溫孵育2h，然后再加入藥物濃度為100μM的ATP256μl，放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）。恒溫孵育后，將以上細胞轉移至15ml離心管。恒溫下離心7分鐘（1500rpm/min）后溶液分為上清液及沉淀層，取上清液200μl行酶聯(lián)免

6、疫吸附試驗(ELISA)測定IL-1β及IL-18的表達，余上清用槍頭吸凈棄之，剩余細胞沉淀用來提取RNA行realtime-PCR測定NLRP3、caspase-1的表達情況。
　　 結果:
　　 1、應用MDP及ATP單獨刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相比較，單核細胞上清液中IL-1β及IL-18的表達為:TATP組和TMDP組與空白組比較均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，TMDP+ATP組與空白組、

7、TMDP、TATP組比較有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 2、應用MDP及ATP單獨刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相比較，單核細胞中NLRP3mRNA的表達為:TATP組與空白組比較略升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，TMDP+TATP組與空白組、TMDP、TATP組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 3、應用MDP及ATP單獨刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相

8、比較，單核細胞中caspase-1mRNA的表達為:TMDP組和TATP組與空白組比較均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，TMDP+TATP組與空白組、TMDP、TATP組比較有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、NOD2的特異性配體MDP單獨刺激THP-1后NLRP3無表達，下游炎癥因子caspase-1及IL-1β、IL-18較弱表達。
　　 2、NOD2的特異性配體M