結(jié)核桿菌耐熱抗原對(duì)人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌SP-B和凋亡的影響.pdf

1、背景及目的：現(xiàn)有對(duì)于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, M.tb）的研究主要是通過M.tb的自身成分或其分泌成分刺激誘導(dǎo)不同免疫細(xì)胞（DC細(xì)胞、γδT細(xì)胞等）來研究其相關(guān)作用機(jī)制，但對(duì)于抵御M.tb入侵肺部過程中發(fā)揮重要作用的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial typeⅡcell, AT2）的研究還鮮見報(bào)道。已知臨床上廣泛使用的結(jié)核病（tuberculosis, TB）疫苗-卡介苗

2、（Bacille-Calmette-Guerin, BCG）存在著對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)不穩(wěn)定的不足，因此新靶向藥物的研發(fā)也成為TB治療的新研究課題。本實(shí)驗(yàn)研究從M.tb入侵人體肺部的重要屏障——AT2細(xì)胞為切入點(diǎn)，選用與 AT2細(xì)胞具有相同表型和特征的人肺腺癌細(xì)胞系（human lung adenocarcinoma cell line, A549）細(xì)胞，通過結(jié)核桿菌耐熱抗原（Mycobacterium tuberculosis heat-

3、resistant antigen, Mtb-HAg）刺激誘導(dǎo)A549細(xì)胞，探討對(duì)A549細(xì)胞分泌肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B（pulmonary surfactant-associated protein B, SP-B）的作用和對(duì)其凋亡的影響。進(jìn)而間接研究Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞分泌SP-B和凋亡的作用，為較好的研究肺部感染TB早期AT2細(xì)胞抵御M.tb入侵的機(jī)制提供新的理論依據(jù)；同時(shí)初步探究Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞的凋亡作用，為

4、進(jìn)一步深入研究其作用通路提供新的思路。
　　方法：（1）用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%雙抗的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Media, DMEM）培養(yǎng)基，在37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞；用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的Mtb-HAg工作液，分別刺激誘導(dǎo)A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h,48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。（2）采用酶聯(lián)免疫吸

5、附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法分別檢測(cè)空白對(duì)照組1、陽性對(duì)照組（脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h）和實(shí)驗(yàn)組1（不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h,48 h）的培養(yǎng)上清中SP-B的表達(dá)量。（3）使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）法分

6、別檢測(cè)空白對(duì)照組1、陽性對(duì)照組（LPS刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h）和實(shí)驗(yàn)組1（不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h,48 h）中目的基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量變化。（4）運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry, FCM）分別檢測(cè)空白對(duì)照組2、陽性對(duì)照組（姜黃素刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h）和實(shí)驗(yàn)組2（不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h）的細(xì)胞凋亡率變化。
　　結(jié)果：（1）與空白對(duì)照組1相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)相同時(shí)間，陽

7、性對(duì)照組（LPS組）和實(shí)驗(yàn)組1（不同濃度Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)相同時(shí)間）的SP-B表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組1（相同濃度Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間）的SP-B表達(dá)量降低不明顯（P>0.05）。（2）相同培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組1（不同濃度的Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)）和陽性對(duì)照組（LPS組）中基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在相同的Mtb-HAg優(yōu)勢(shì)

8、刺激誘導(dǎo)濃度下，實(shí)驗(yàn)組1基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（3）陽性對(duì)照組（姜黃素組）的A549細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組2中A549細(xì)胞的凋亡率均與空白對(duì)照組2相比，均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但實(shí)驗(yàn)組2之間A549細(xì)胞的凋亡率變化不顯著（P>0.05）。
　　結(jié)論：（1）Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞的體外模型A549細(xì)胞的