石杉堿甲酶標納米金探針檢測方法的研究.pdf

1、石杉堿甲(HupA)是一種高效且可逆的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，是目前治療老年癡呆癥（又稱阿爾茨海默病，AD）最有前景的藥物。隨著世界人口老齡化的加快，阿爾茨海默病患者逐年增加，國內外對其需求量日益增加。當前醫(yī)學界尚沒有發(fā)現合適的HupA替代品，人工合成法也局限于實驗室使用，目前HupA主要從石杉屬和馬尾杉屬等植物中提取獲得，然而該類植物野生資源匱乏，且HupA含量甚微。因此建立高靈敏度的HupA檢測方法，對充分利用該類資源具有十

2、分重要的現實意義。
　　近年來，納米技術發(fā)展迅速，尤其是納米金標記技術備受業(yè)界關注。該技術具有簡便、快速、準確及無毒等優(yōu)點，為藥物的分析測定提供一種新的研究思路。納米金的表面積大、生物兼容性好，其表面能夠通過靜電作用與抗體、酶等生物大分子相結合，還可以與巰基或PolyA修飾的DNA相結合，形成探針后后生物分子的活性基本不受影響，且性質較為穩(wěn)定，這些功能化的納米金探針用于免疫分析中，可顯著提高方法的檢測靈敏度。免疫磁珠（磁珠探針）是

3、近年來新興的一種功能材料，指偶聯了抗原或抗體的磁性微球。磁珠具有較強的磁響應性，通過引入磁場，可以實現快速分離、富集目標物，具有操作簡便、快速高效和不影響生物活性等優(yōu)點，在免疫分析領域、細胞分離等方面具有獨特的優(yōu)越性。
　　本論文利用納米金探針和磁珠探針的特性，以競爭免疫分析為基礎，研發(fā)了檢測HupA的新型酶標免疫分析方法，并應用于實際樣品的含量測定，為藥物中有效成分的微量測定提供新的分析策略。論文共分為三章，主要內容如下:

4、>　　第一章:酶標納米金探針檢測石杉堿甲的方法研究。
　　采用檸檬酸三鈉還原法合成納米金，將酶和抗體修飾于納米金顆粒表面制備納米金探針，并對探針制備條件進行優(yōu)化，如標記pH、最適抗體標記量、酶和抗體標記比例等，采用紫外分光光度法和透射電鏡對制備好的納米金探針進行表征。將制備好的納米金探針引入到免疫分析中，采用競爭免疫分析模式，建立了一種檢測HupA的新方法。并對實驗條件如包被抗原和納米金探針稀釋比例、最佳競爭反應時間進行了優(yōu)化，在

5、最佳實驗條件下，該方法測定HupA的線性范圍為0.5～150ng/mL，線性方程為I=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960)，檢測限為602.56 pg/mL。將該法應用于蛇足石杉中HupA含量測定，經國標法驗證，二者測定結果基本一致，回收率在97.08～106.11％之間，結果較好。該法檢測時間短，靈敏度高且重復性好，是一種簡便、高效、經濟的檢測體系，有利于推廣應用。
　　第二章:磁珠和酶標納米金探針檢測石杉堿甲

6、的方法研究。
　　本研究引入磁性載體-磁珠，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的96孔酶標板，將石杉堿甲完全抗原(HupA-OVA)標記在磁珠上?；诖判苑蛛x，利用納米金探針，建立了快速、高效、靈敏度高的檢測石杉堿甲的酶標免疫新方法。考察并優(yōu)化了磁珠探針和納米金探針的稀釋比例、最佳競爭反應時間等免疫分析條件，最終確立了檢測體系，在優(yōu)化實驗條件下，該方法在HupA濃度為0.075～180ng/mL之間，抑制率與HupA濃度的對數值lgC呈良好的線性關系，線性

7、方程為I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950)，檢測限為160.32 pg/mL。將該法應用于石杉堿甲片劑含量測定，檢測結果與國標法所測結果基本一致，該方法的靈敏度較前一種方法更高、線性范圍更寬且縮短了檢測時間。
　　第三章:磁珠和DNA-納米金探針檢測石杉堿甲的方法研究。
　　在前兩種方法研究的基礎上，基于磁珠建立了DNA-納米金探針檢測方法，并對該方法的精密度、重復性、專屬性等進行了考察，結果均在允許范