MicroRNA對鐵觀音茶樹干旱脅迫響應機制研究.pdf

1、干旱是在我國主要產(chǎn)茶區(qū)普遍發(fā)生的主要自然災害，且茶樹是一種葉用植物，其生長的健康與否直接影響茶葉的品質(zhì)。愈來愈多的研究表明microRNA(miRNA)在植物干旱脅迫響應中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為研究miRNA對鐵觀音茶樹干旱脅迫的相應機制，本文采用補水稱重法，對干旱脅迫的鐵觀音茶樹進行sRNA分離鑒定，對鐵觀音茶樹不同程度干旱脅迫過程中的部分相關(guān)miRNA進行定量表達分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1、鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中主要

2、生化成分變化
　　本研究采用補水稱重法對盆栽鐵觀音茶苗進行正常供水（對照CK）、輕度干旱脅迫（T1）、中度干旱脅迫（T2）、重度干旱脅迫（T3）四組處理，研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫程度的增強，葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量的下降，葉片光合速率減弱。干旱脅迫程度的加劇引發(fā)植物的膜質(zhì)損傷，使植物葉片中MDA的含量增加，電解液外滲，電導率增強。當鐵觀音茶樹遭受輕度干旱脅迫和中度干旱脅迫時，鐵觀音茶樹葉片MDA含量略有增加，植物細胞電導率略

3、微增強。當鐵觀音茶樹遭受重度脅迫時，葉片中MDA含量及葉片電導率增加趨勢明顯。
　　2、Solexa測序技術(shù)鑒定鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中的sRNA
　　通過Tripure試劑提取得到的不同處理的不同干旱脅迫處理的鐵觀音茶樹葉片總RNA滿足Solexa測序要求，通過對干旱脅迫鐵觀音茶樹葉片RNA樣品進行miRNA測序，測序結(jié)果如下：
　?。?）鐵觀音茶樹正常水分、輕度脅迫、中度脅迫及重度脅迫四個處理的樣品中分別獲得157

4、77773、13218397、14510362和13452128條clean reads序列，其所占總測序數(shù)據(jù)比例分別為99.86％、99.58%、99.59%、98.95%。獲得的sRNA樣品峰值為24nt，測序所得的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。
　?。?）基于茶樹基因組數(shù)據(jù)的未知性，選用模式植物擬南芥基因組為參考基因組，同時與Genbank中已經(jīng)公布的茶樹基因信息及Rfam3等數(shù)據(jù)庫比對，得到注釋的miRNA比例分別為5.60%、7.35%

5、、7.66%、15.78%。鐵觀音茶樹干旱脅迫的四個樣品中未知的sRNA數(shù)據(jù)龐大，miRNA的探究依舊存在大量的未知性。
　?。?）為進一步鑒定茶樹miRNA,進行鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄組測序，同時以鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄組為參考數(shù)據(jù)，鑒別茶樹novel miRNA。結(jié)果表明：以鐵觀音茶樹轉(zhuǎn)錄組為參考數(shù)據(jù)庫比較分析后，在鐵觀音茶樹不同干旱處理樣品中共得到176條茶樹miRNA序列信息，其中分屬于5個家族的7條序列在miRBase數(shù)據(jù)庫中可以得到相

6、應注釋信息，絕大多數(shù)為未知miRNA序列信息或鐵觀音茶樹特有的miRNA信息。
　?。?）在鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中絕大多數(shù)的miRNA處于低豐度狀態(tài)，低豐度表達的miRNA數(shù)量龐大，同一家族中不同miRNA成員存在表達豐度差異，對調(diào)控同一靶基因的不同miRNA間同樣也存在表達豐度的差異性。
　?。?）依據(jù)鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中miRNA的差異表達情況，結(jié)合miRNA及其靶基因功能預測，推斷出19個miRNA可能與鐵觀音茶

7、樹干旱脅迫存在密切相關(guān)性。其中包括12個conserved miRNA：csi-miR156/159a/165a-3p/166a/166g-3p/167d/2199/398/408b-5p/535a/6170/894，7個novel miRNA：csi-miR4/7/12/18/24/26/28。
　　大多數(shù)預測得到的miRNA的靶基因為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控目的基因在特定的時間與空間中表達。同時，在鐵觀音茶樹干旱脅迫中的miRNA也在蛋

8、白質(zhì)合成及代謝、植物器官發(fā)育及形態(tài)建成等諸多生命活動中具有調(diào)控作用。
　　3、鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中相關(guān)miRNA的定量表達分析
　　為研究miRNA在鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中的表達量差異，選用鐵觀音茶樹正常供水（對照）、輕度干旱脅迫、中度干旱脅迫、重度干旱脅迫的四個處理的葉片總RNA為試驗材料，對19個與鐵觀音茶樹干旱脅迫相關(guān)的miRNA在干旱脅迫階段的表達量情況分析后發(fā)現(xiàn)：csi-miR156、csi-miR398、c

9、si-miR7均呈現(xiàn)“上升型”表達，在鐵觀音茶樹的干旱脅迫中起正相關(guān)作用；csi-miR165a-3p、csi-miR159a、csi-miR167d、csi-miR408b-5p及csi-miR6170、csi-miR5、csi-miR12、csi-miR18、csi-miR26、csi-miR28在鐵觀音茶樹干旱脅迫過程中均呈現(xiàn)“先升后降”的表達趨勢；csi-miR166a、csi-miR166g-3p、csi-miR435a、cs

10、i-miR894、csi-miR2199、csi-miR24均呈負相關(guān)作用。
　　4、MiR166家族的靶基因克隆及定量表達分析
　　本研究采用同源克隆法，得到 miR166家族靶基因 HD-ZipIII家族成員ATHN-14-like、ATHN-15-like基因片段，片段長度分別為1246bp及522bp。采用qPCR技術(shù)對ATHN-14-like、ATHN-15-like基因進行定量表達分析，同時比照miR166a、m

11、iR166g-3p在各處理樣品中的定量表達情況后發(fā)現(xiàn)：
　?。?）在鐵觀音茶樹輕度脅迫、中度脅迫、重度脅迫三個樣品中，miR166a及miR166g-3p的相對表達量均較正常供水樣品呈現(xiàn)下降趨勢時，HD-ZipIII家族ATHN-14-like、ATHN-15-like基因的相對表達量較正常水分樣品則均呈現(xiàn)升高趨勢。
　?。?）當miR166a、miR166g-3p在鐵觀音茶樹不同處理的干旱脅迫中呈現(xiàn)負相關(guān)作用時，ATHN-