馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)RNA干擾核心元件基因的克隆與驗(yàn)證.pdf

1、馬鈴薯甲蟲 Leptinotarsa decemlineata(Say)是馬鈴薯上的重要害蟲，也是我國重大檢疫對象。目前馬鈴薯甲蟲的防治手段過于依賴化學(xué)藥劑，導(dǎo)致馬鈴薯甲蟲幾乎對所有已注冊化學(xué)農(nóng)藥都產(chǎn)生了不同程度的抗性。目前急需研究新的化學(xué)防治替代技術(shù)。RNA干擾專一性強(qiáng)，對環(huán)境友好，是一種潛在的害蟲防治新技術(shù)。而目前RNA干擾仍不能應(yīng)用到田間防控，其最主要的原因在于，dsRNA穩(wěn)定性較低，昆蟲中 RNA干擾的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式不甚明了，還有

2、昆蟲中的 RNA干擾的作用機(jī)制報(bào)導(dǎo)相對較少。
　　本研究對馬鈴薯甲蟲的6個(gè)RNA干擾核心元件基因進(jìn)行了克隆，多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，通過qPCR技術(shù)對這6個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析，通過RNA干擾技術(shù)對這6個(gè)基因的功能進(jìn)行了闡述。主要獲得了以下的結(jié)果：
　　1、利用馬鈴薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，通過相似性搜索軟件bla st搜索獲得了馬鈴薯甲蟲的兩個(gè)Sid-1，兩個(gè)Dicer-2和Ago-2 cDNA序列。通過提取馬鈴薯

3、甲蟲的總RNA，反轉(zhuǎn)錄和PCR等一系列分子生物學(xué)技術(shù)，克隆獲得了2個(gè)Sid-1和Dicer-2的全長序列，2個(gè)Ago-2的部分序列。通過對馬鈴薯甲蟲，黑腹果蠅和赤擬谷盜等Sid-1的蛋白質(zhì)序列的多重序列比對，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲的2個(gè)S id-1具有昆蟲Sid-1的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域，包括一段信號肽，4段保守基序和11個(gè)跨膜域，表明馬鈴薯甲蟲的這2個(gè)Sid-1應(yīng)具有昆蟲Sid-1的功能。通過系統(tǒng)發(fā)育聚類分析，2個(gè)馬鈴薯甲蟲的Sid-1分別與赤擬谷盜的

4、TcS id-1a和TcS id-1c相似性最高，由此將馬鈴薯甲蟲的這2個(gè)Sid-1分別命名為LdSid-1a和LdSid-1c。2個(gè)Dicer-2和2個(gè)Ago-2在前人的研究中已經(jīng)進(jìn)行了序列分析和命名。
　　2、組織表達(dá)和齡期表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：（1）參與RNA干擾過程的6個(gè)基因（除LdAgo2b)在齡期表達(dá)具有相似的表達(dá)情況，即隨幼蟲的生長發(fā)育，表達(dá)量逐漸升高，LdAgo2b則是在4L剛蛻皮和72h大小的幼蟲中具有較高的表達(dá)，而在其

5、它階段都僅為痕量表達(dá)，表明這些元件基因在馬鈴薯甲蟲的高齡幼蟲階段參與了重要的生理功能；（2）對馬鈴薯甲蟲的4L老熟幼蟲的各個(gè)組織和成蟲的生殖腺中測定了組織表達(dá)情況，結(jié)果表明這6個(gè)元件基因（除 LdAgo2b)在各個(gè)組織中均有表達(dá)，且在腸道中表達(dá)量均較高，因此選用喂食的方法進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)。
　　3、通過喂食 dsRNA的方法，對 RNA干擾核心元件基因 LdDicer2a， LdDicer2b，LdAgo2a，LdAgo2b，L

6、dSid-1a和LdSid-1c的基因功能進(jìn)行了研究。首先，對三齡幼蟲喂食(1)LdSid-1a(2)LdSid-1c(3)LdDicer2a(4)LdDicer2b(5)LdAgo2a(6)LdAgo2b(7)LdSid-1a和LdSid-1c(8)LdDicer2a和LdDicer2b(9)LdAgo2a和LdAgo2b的dsRNA，分別觀察這些處理組的幼蟲取食量，行動力，化蛹率和羽化率。發(fā)現(xiàn)無論是單獨(dú)干擾還是混合干擾元件基因均不會

7、對馬鈴薯甲蟲的幼蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)，也沒有觀察到幼蟲化蛹和羽化后翅的畸形表型。為了進(jìn)一步研究這些基因在RNA干擾過程中的作用，選定了致死基因dsATPaseE作為研究工具。首先測定了dsATPaseE對馬鈴薯甲蟲4L幼蟲的LC50為表達(dá)菌液稀釋的1/883。通過九組預(yù)處理元件基因的dsRN A，再于處理后3d喂食稀釋10倍，稀釋100倍和稀釋1000倍的dsATPaseE菌液，發(fā)現(xiàn)在LdAgo2和LdDicer2的處理組中，單獨(dú)干擾的處理組

8、能部分緩解ds ATPa seE的致死效應(yīng)，混合處理組能基本恢復(fù)dsATPaseE的致死效應(yīng)。而在(1)dsSid-1a(2)dsSid-1c(3)dsSid-1a和dsSid-1c的處理組中，無論dsATPa se E稀釋10倍，稀釋100倍還是稀釋1000倍，雖然通過qPCR成功檢測到這些基因已經(jīng)成功通過RN A干擾降低了表達(dá)，但是這些處理組的表型結(jié)果和對ATPase E的表達(dá)量檢測結(jié)果均與dse gfp的處理結(jié)果較為相似。說明Ld