CYP1A1基因在豬支原體肺炎發(fā)病過程中的功能研究.pdf

1、豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病。細胞色素P450是一種含高鐵血紅素的蛋白酶，主要參與催化機體內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的氧化反應，參與機體內(nèi)藥物的氧化代謝和類固醇類物質(zhì)的生物化學轉化。豬CYP1A1屬于豬P450家族，是機體代謝活化多烷芳烴、芳香胺類前致癌物質(zhì)主要功能酶，最新研究表明細胞色素P450在炎癥反應中也發(fā)揮作用。
　　目的:通過構建不同表達水平的CYP1A1基因的豬肺泡巨噬細胞模型，構建豬支原體

2、肺炎體外感染模型，探究CYP1A1基因在豬肺炎支原體感染炎癥反應過程中的功能。
　　方法:RT-PCR擴增豬CYP1A1基因，目的片段純化后與pMD18-T載體連接，轉化感受態(tài)細胞后菌液擴增，得到pMD18-T-CYP1A1重組質(zhì)粒并測序鑒定，用NotI和XhoI分別對重組質(zhì)粒及pcDNA3.1(+)/zeo進行雙酶切，T4 DNA連接酶連接酶切并純化后的線性DNA片段，轉化感受態(tài)細胞，菌液擴增，獲得真核表達載體pcDNA3.1(

3、+)/zeo-CYP1A1質(zhì)粒，將該質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000轉染至豬肺泡巨噬細胞系3D4/21，zeocin抗性篩選獲得CYP1A1過表達細胞系，RT-PCR、Western-blot鑒定基因表達;用CYP1A1基因siRNA轉染巨噬細胞干擾CYP1A1表達，獲得Si組細胞。用豬肺炎支原體感染過表達細胞，對照組和陰性對照組細胞、Si組細胞，檢測炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PPAR-γ受體基因的mRNA表達水平。<

4、br>　　結果:
　　1、成功克隆獲取豬CYP1A1基因序列，NCBI比對結果吻合率達99％，且成功構建真核表達載體，酶切鑒定正確。
　　2、Zeocin濃度為100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml五個梯度篩選細胞，300μg/ml一周內(nèi)全部死亡，250μg/ml組細胞在第14天全部死亡，其他細胞存活至第三周。
　　3、以6孔板進行細胞轉染，Zeocin篩選，28日后觀

5、察到穩(wěn)定的抗性克隆，其中，質(zhì)粒體2000的量為3.75ul/孔，重組質(zhì)粒為2.5ug/孔的轉染效果最佳。
　　4、篩選得到的細胞，RT-PCR檢測到CYP1A1的表達，Western-blot檢測到CYP1A1的高表達。
　　5、siRNA轉染細胞干擾CYP1A1基因的表達，定量PCR對siRNA轉染效率進行了評估，干擾效果顯著。
　　6、感染炎癥后，各處理組炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達

6、量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，其中CYP1A1過表達組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達量出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P＜0.01)的時間為4h、24h、12h、4h;正常組和空載組細胞TNF-α、IL-1β和、IL-6、IL-8出現(xiàn)極顯著上調(diào)的時間分別為4h、12h、12h、4h; Si組細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8出現(xiàn)極顯著上調(diào)的時間分別為4h、4h、12h、4h。感染后相同時間點炎性因子表達量比較，過表組細胞在感染

7、后的大部分時間段炎性因子表達量均顯著低于空載組和正常組(P＜0.05)，其中TNF-α表達量在4h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-1β表達量在12h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-6表達量在4h、12h極顯著低于空載組和正常組(P＜0.01); IL-8在12h極顯著低于其他各處理組(P＜0.01)。Si組細胞在感染后的大部分時間段炎性因子表達量均顯著高于空載組和正常組(P＜0.05)，其中，TNF-

8、α的表達量在12h極顯著高于空載組和正常組(P＜0.01);IL-1β表達量在4h和24h極顯著高于正常組和空載組(P＜0.01); IL-8的表達量在24h極顯著高于空載組和正常組(P＜0.01)。
　　7、各處理組細胞PPAR-γ均12h出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P＜0.01)，過表達組細胞在感染前后大部分時間點PPAR-細表達量顯著高于空載組和正常組(P＜0.05)，Si組細胞在感染前后大部分時間點PPAR-γ表達量顯著低于空載組和正