Follistatin對鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響及其作用機制的初步研究.pdf

1、Follistatin作為TGF-β超家族的一個成員，在哺乳動物胚胎期骨骼肌及其生長發(fā)育的過程中發(fā)揮著廣泛的生理作用，在骨骼肌細胞增殖、調節(jié)肝功能、誘導紅細胞再生、神經(jīng)細胞分化等多種信號調節(jié)通路中也發(fā)揮著重要作用。因此，探索Follistatin對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響，同時期望探索Follistatin對鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的作用機制，希望為深入研究Follistatin調控鴨骨骼肌生長發(fā)育的作用機理奠定基礎。
　　本實驗以孵

2、化14d的鴨胚為試驗材料，采用差速貼壁的方法分離培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞，使用濃度分別為0、1、10、100ng/ml的Follistatin處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，采用CCK-8檢測骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖情況，使用抗pax7抗體染色，DAPI染核，鑒定骨骼肌衛(wèi)星細胞;使用流式細胞儀檢測骨骼肌衛(wèi)星細胞周期變化情況;采用real-time qPCR方法檢測Follistatin對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖過程中的標記基因PCNA，基因

3、MyoD以及TGF-β信號通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表達的影響;Western blot檢測Smad2和Smad3蛋白表達及其磷酸化水平，確定Follistatin對鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖影響及其作用機制。主要結果如下:
　　1.通過使用Pax7抗體進行免疫熒光染色，結果顯示有95％以上的Pax7呈陽性表達，說明培養(yǎng)的細胞為骨骼肌衛(wèi)星細胞。
　　2.通過CCK-8檢測不同濃度Follistatin(0、1、1

4、0、100ng/ml)對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響，結果表明10ng/ml的Follistatin對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖效果最明顯(P＜0.01)。
　　3.采用Pax7進行免疫熒光染色顯示，與對照組相比，Pax7陽性表達顯著升高(P＜0.05)。流式檢測骨骼肌衛(wèi)星細胞周期變化結果顯示，與對照組相比，細胞G1期顯著降低(P＜0.05)，而G2期和S期顯著升高(P＜0.05)。real-time qPCR方法檢測PCNA、MyoD基因的

5、表達情況，與對照組相比，結果顯示PCNA基因表達量顯著升高(P＜0.01)，MyoD基因表達量顯著降低(P＜0.05)。通過使用real-time qPCR方法檢測TGF-β、 Smad2和Smad3基因的表達量，與對照組相比，結果表明TGF-β、Smad2和Smad3基因的表達量都顯著升高(P＜0.01)。 Western blot檢測結果表明Smad2和Smad3的蛋白表達及其磷酸化水平顯著升高(P＜0.05)。
　　4.使用

6、LY2109761抑制劑處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞后，采用流式細胞儀檢測骨骼肌衛(wèi)星細胞周期的變化情況，結果表明，與對照組相比，LY(LY2109761)抑制劑處理組中，細胞G1期顯著升高(P＜0.05)，細胞S期和G2期顯著降低(P＜0.05)。Realtime qPCR檢測MyoD、PCNA、TGF-β、Smad2和Smad3基因的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)MyoD基因和PCNA基因分別呈現(xiàn)顯著上升和下降(P＜0.05)，TGF-β基因表達量沒有顯

7、著變化，Smad2、Smad3基因的表達量顯著降低(P＜0.05)，LY2109761抑制劑和Follistatin共同處理鴨骨骼肌衛(wèi)星細胞后，細胞G1期顯著升高(P＜0.05)，細胞S期和G2期顯著降低(P＜0.05)。MyoD基因和PCNA基因分別呈現(xiàn)顯著上升和下降(P＜0.05)，TGF-β基因表達量顯著升高(P＜0.05)，Smad2、Smad3基因的表達量顯著降低(P＜0.05)，Western blot檢測Smad2、Sma