內(nèi)毒素休克小鼠肝臟線粒體差異蛋白質組的鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應癥候群，膿毒癥的嚴重并發(fā)癥-感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計表明，臨床半數(shù)的膿毒癥是由革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)引起的，在革蘭氏陰性菌的細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內(nèi)毒素(endotoxin)，被認為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機體

2、多組織器官，其中內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞是最主要的效應細胞，在LPS的刺激下，它們產(chǎn)生大量的細胞因子，即”細胞因子風暴”(cytokine storm)，進而引起失控性的炎癥級聯(lián)反應，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction，MOD)。
　　 過去十年，研究者們致力于研究膿毒癥的發(fā)病機制，并用內(nèi)毒素抗體和腫瘤壞死因子等炎癥因子的拮抗劑進行了大量的動物實驗和臨床實驗，但

3、均未收到滿意的效果，至今膿毒癥的死亡率仍居高不下。這都提示我們對膿毒癥特別是內(nèi)毒素休克的認識還有待加深。越來越多的證據(jù)顯示重要器官的線粒體損傷在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中扮演著至關重要的角色，但是其病理生理過程的分子機制仍然未明確。
　　 線粒體(mitochondria)是真核細胞非常重要的細胞器，被譽為“細胞能量發(fā)動機”。一般呈粒狀或桿狀，也可呈環(huán)形、啞鈴形或其他形狀，其主要化學成分是蛋白質和脂類。線粒體由內(nèi)外兩層膜封閉，包括外膜、內(nèi)

4、膜、膜間隙和基質四個部分。它在細胞內(nèi)的分布一般是不均勻的，根據(jù)細胞代謝的需要，線粒體可在細胞質中運動、變形和分裂增殖。其主要功能是進行氧化磷酸化來合成ATP，為細胞生命活動提供直接能量。線粒體除了為細胞提供能量外，還在細胞內(nèi)氧自由基的生成、細胞凋亡、細胞信號轉導、細胞內(nèi)離子的跨膜轉運以及電解質穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控等過程中發(fā)揮著至關重要的作用。
　　 許多實驗證實，線粒體蛋白質結構與功能的改變與人類許多疾病相關，如退行性疾病、心臟病、衰

5、老和癌癥。尤其是在神經(jīng)退行性疾病方面，線粒體蛋白質的研究日益受到關注。
　　 內(nèi)毒素休克早期究竟線粒體發(fā)生了哪些功能事件?其具體分子機制如何?目前所知有限。這些問題的解答，對從分子水平加深膿毒癥發(fā)病機制的認識是有益的。然而內(nèi)毒素休克過程中線粒體發(fā)生的功能事件最終是由蛋白質來執(zhí)行的。是哪些蛋白發(fā)生了改變呢?差異蛋白質組學方法可以揭開這一神秘的面紗。
　　 差異蛋白質組學能通過比較樣本間蛋白質表達水平的變化，尋找差異分子，用

6、以解決各種各樣的生物學問題。差異蛋白質組學研究技術的不斷革新使得從整體上研究線粒體蛋白質組在生理、病理過程中的變化成為可能。目前己涌現(xiàn)出許多新穎的差異蛋白質組分析方法，其中熒光差異凝膠電泳(difference gelelectrophoresis，DIGE)技術由于繼承了二維凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)的高分辨率，同時又具備高重現(xiàn)性、高靈敏度、高通量和高動態(tài)范圍等優(yōu)勢，使得DIGE

7、日益受到關注，成為最受歡迎的定量蛋白質組學研究手段之一。
　　 DIGE是一種在2-D電泳之前進行熒光染料標記蛋白樣品的方法，通過對不同的蛋白樣品用不同的熒光染料進行標記，在同一塊雙向凝膠中可同時分離多至三種不同的蛋白樣品，并且每塊膠上又引用了內(nèi)標，內(nèi)標的利用進一步增加可信度，確保結果能反映出真實的生物學差異，避免了系統(tǒng)誤差實驗結果的影響，從而能夠對樣品間蛋白質豐度差異進行精確分析。DIGE系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是整合了CyDye D

8、IGE染料多重標記方法與DeCyder2D差異分析軟件的優(yōu)勢。DeCyder2D差異分析軟件利用了共找點檢測的算法，能對熒光圖像進行自動檢測、背景消除、定量、歸一化以及凝膠內(nèi)匹配，避免了人為因素的影響，消除了不同操作者帶來的系統(tǒng)誤差。既然DIGE具有如此多的優(yōu)點，那么利用此技術平臺將有很大機遇來揭示內(nèi)毒素休克小鼠肝臟線粒體差異蛋白質組所蘊藏的信息，為深入研究膿毒癥的分子機制提供新的方法。
　　 本實驗首先建立了一套基于熒光差異雙

9、向電泳分離技術.基質輔助激光解析離子化-飛行時間/飛行時間質譜儀鑒定技術(matrix assisted laser desorptionionization-time of flight/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF)-生物信息學分析技術(bioinformatics)的差異蛋白質組學技術平臺，并且對其靈敏度和重現(xiàn)性進行了考察。然后復制了BALB/c小鼠內(nèi)毒素休克模型，取

10、LPS刺激1小時(hour，hr)組和正常對照組小鼠，麻醉后取其肝臟，利用差速離心和密度梯度離心方法來提取純化肝臟線粒體，并裂解得到線粒體的全蛋白，用DIGE技術建立了內(nèi)毒素休克早期小鼠肝臟線粒體差異蛋白質組表達譜，通過DeCyder2D差異分析軟件分析后找到差異蛋白點26個，表達上調(diào)和下調(diào)的各13個。對這些差異蛋白點利用MALDI-TOF/TOF質譜儀進行蛋白質鑒定，共鑒定出22種蛋白質。
　　 這些差異蛋白的同時出現(xiàn)，必定意

11、味著它們之間有著直接或間接的聯(lián)系，如何找到它們之間的聯(lián)系，并且挖掘出這些聯(lián)系在內(nèi)毒素休克肝臟線粒體中的病理生理學意義，得出一個框架性的認識，為進一步深入的研究指明道路，這也是目前功能蛋白質組學十分關注和亟待解決的問題。而生物信息學(bioinformatics)可以作為解決這個問題的有用工具。我們首先對鑒定的差異蛋白進行亞細胞定位分析，利用亞細胞定位軟件WoLF PSORT進行檢索。結果完全定位于線粒體內(nèi)的有2個；既可定位于線粒體內(nèi)，又

12、可定位于胞漿的有8個；既可定位于線粒體內(nèi)，又可定位于其它多個亞細胞器的有6個；在其它亞細胞結構定位，但是沒有定位于線粒體內(nèi)的有10個。這也說明線粒體的提取是成功的。
　　 通過定位分析后，我們分別對蛋白質進行功能分析，利用蛋白質數(shù)據(jù)庫的蛋白質結構域(domain)和模體(motif)的分析，粗略地對鑒定的蛋白質進行功能分組，把這些差異蛋白功能主要歸納為以下5類：參與蛋白質和脂質代謝；參與能量代謝；參與氧自由基生成調(diào)節(jié)；參與細胞凋

13、亡；參與細胞信號轉導。
　　 然而僅僅以此，還不能達到了解蛋白質間相互關系的目的，還需要對蛋白質間的相互作用進行預測和分析。我們利用String蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫對這22種蛋白進行了一級相互作用(直接作用)的分析，結果發(fā)現(xiàn)這些蛋白質中，有2組蛋白質是發(fā)生直接的相互作用的。其中一組是非特異脂質轉移蛋白(Sterolcarrier protein2，Scp-2)與植烷酸氧化酶(lupus nephritis-associated p

14、eptide1，Ln1)，這兩個蛋白均在線粒體內(nèi)有定位，在LPS刺激1小時后線粒體內(nèi)均表達下調(diào)，且下調(diào)倍數(shù)一致，為-2.0左右。這兩個蛋白質形成的復合物可能參與維持脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)。另外一組是白蛋白(serum albumin，Alb)、α-1-抗胰蛋白酶1-1(α-1-antitrypsin1-1，Aat2)和甲狀腺素轉運結合蛋白(Transthyretin，Ttr)，它們在LPS刺激1小時的線粒體內(nèi)含量同時上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)均在2.0

15、左右。通過軟件預測三者都定位在血漿中，在線粒體內(nèi)沒有定位，而通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)Ttr在炎癥刺激下的血漿中是表達量減少的，而我們在線粒體內(nèi)卻出現(xiàn)了三者含量同時增加的現(xiàn)象，這是一個非常有意義的發(fā)現(xiàn)。我們推測在LPS刺激下三者可能以某種功能復合物的形式由血漿轉位入線粒體，參與細胞對內(nèi)毒素的應激反應。
　　 通過研究，我們得出以下五點結論：
　　 1.建立了DIGE技術平臺，為實驗室進行差異蛋白質組學研究提供了一種高可信度、高重復

16、性的技術系統(tǒng)。
　　 2.成功提取并純化得到小鼠肝臟線粒體，并進行透射電鏡驗證。
　　 3.建立了正常和內(nèi)毒素休克早期BALB/c小鼠肝臟線粒體蛋白質組的差異雙向電泳圖譜。
　　 4.用差異軟件分析得到26個差異蛋白點，并進行質譜鑒定，結果鑒定出22種差異蛋白質。
　　 5.對22種差異蛋白質進行生物信息學分析，預測出2個有直接相互作用的蛋白質-蛋白質復合物。
　　 通過實驗技術方法的探索，我們建