盾殼霉CmRV基因組的全長cDNA克隆及轉化ZS-1的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌，在世界范圍內廣泛分布，在菌核病的生物防治中有著非常重要的作用。真菌病毒CmRV是來自盾殼霉菌株Chy-1的dsRNA病毒，它的全長基因組的序列已被測序完成，屬于Totiviridae(全病毒)科，對寄主沒有顯著的影響。 本研究中采用反向遺傳學技術對CmRV進行研究，通過分段RT-PCR的方法分別克隆了病毒

2、基因組的5' 端和3'端cDNA片段，連接pMD18-T得到病毒全長cDMA的亞克隆，再構建全長克隆的方法得到了含有全長cDNA克隆的重組質粒。 在研究過程中發(fā)現(xiàn)于2003年測定并提交的CmRV全序列多出了21個堿基，CmRV實際大小為4954nt。由于這21個堿基在3'端的非翻譯區(qū)，因此并不影響CmRV的分類地位和對其所表達的外殼蛋白(CP)和依賴RNA的RNA聚合酶(RdRP)的推定。 通過酶切得到了CmRV全長基因

3、組cDNA片段，連入p1301-V的構巢曲霉的trpC啟動子下游的多克隆位點，得到了全長cDNA的正向表達轉化載體pCmRV-cDNA(+)和反向表達轉化載體pCmRV-cDNA(-)：將構建好的載體通過熱擊轉化導入農桿菌EHA105菌株，通過農桿菌介導轉化技術(ATMT)成功轉化盾殼霉ZS-1菌株。 對轉化子的PCR檢測分析表明病毒基因組已經(jīng)整合到盾殼霉ZS-1的染色體上，RT-PCR檢測表明病毒的基因在轉化子細胞內正常轉錄，

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