重組人促紅細胞生成素抑制自噬減輕心肌微血管內皮細胞氧化應激損傷.pdf

1、目的：
　　通過建立過氧化氫（H2O2）誘導的氧化應激損傷模型，觀察不同濃度范圍的重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對心肌微血管內皮細胞氧化應激損傷的保護作用，并初步探討rhEPO的保護作用對自噬的影響和可能的機制。
　　方法：
　　1.選取健康的SD雄性大鼠心臟的左心室心肌，利用改良組織塊貼壁法獲得心肌微血管內皮細胞（cardica microvasc

2、ular endothelial cells, CMECs）；通過倒置顯微鏡對細胞進行形態(tài)學觀察，采用vWF因子相關抗原免疫熒光法對細胞進行鑒定。2.采用H2O2構建心肌微血管內皮細胞氧化應激損傷模型，利用MTT比色法測定細胞存活率，確定H2O2處理細胞造成氧化應激損傷的適宜時間和濃度。3.用不同濃度（5、10、20、40U/ml）rhEPO和200umol/l H2O孵育心肌微血管內皮細胞，用MTT比色法測定細胞存活率，并用化學比色法

3、測定不同rhEPO濃度下心肌微血管內皮細胞上清液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量，確定rhEPO有效濃度范圍。4.用Western-blot方法檢測各組細胞LC3Ⅱ和Beclin1的蛋白表達量，觀察有效濃度范圍的重組人促紅細胞生成素（rhEPO）對氧化應激模型中的心肌微血管內皮細胞自噬水平的影響。5.用Western-blot方法檢測各組細胞p-mTOR的表達量，觀察不同濃度rhEPO對p-mTOR

4、誘導表達的影響。
　　結果：
　　1.原代培養(yǎng)CMECs一周后，細胞形態(tài)多呈梭形和多角形等不規(guī)則形，形成單層緊密排列時呈鵝卵石樣結構；免疫熒光檢測FITC標記vWF相關抗體陽性率90％以上；2.與正常對照組相比，當H2O2濃度為200umol/l，作用時間為2小時，細胞生存狀態(tài)差，心肌微血管內皮細胞存活率顯著降低（p<0.05）。因此本實驗選用200umol/l H2O2，處理2小時，為建模濃度和時間。3.與正常對照組相比，

5、200umol/l H2O2處理的各組細胞，存活率降低(P<0.05)，LDH釋放量增加（P<0.05）；不同濃度rhEPO預處理的細胞，與單純 H2O2組相比，上述指標可明顯逆轉（P<0.05），但40U/mlrhEPO和20U/mlrhEPO相比，逆轉不明顯（P>0.05）。4.與正常對照組相比，單純H2O2處理組LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達水平明顯增高（P<0.05）；不同濃度的rhEPO預處理后，LC3Ⅱ和Beclin1蛋白

6、表達量可明顯減低，與單純H2O2組相比均具有顯著差異（P<0.05）。5.與正常對照組相比，單純 H2O2組p-mTOR的表達降低（P<0.05）;不同濃度的rhEPO預處理后，均能誘導心肌微血管內皮細胞p-mTOR的表達增高，與單純H2O2組相比有顯著差異（P<0.05）,且存在濃度依存性。
　　結論：
　　1.H2O2可以誘導心肌微血管內皮細胞氧化損傷并引起細胞過度自噬；2.一定濃度范圍內rhEPO對H2O2誘導的心肌微