細胞外HSP70對類風濕關節(jié)炎的抗炎作用及機制研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關節(jié)為主要表現的系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病。其病理特征表現為關節(jié)滑膜面的炎癥及滑膜組織的增生導致關節(jié)腔的損傷和關節(jié)的破壞。盡管RA的發(fā)病機制迄今仍未完全闡明，但細胞因子網絡在RA的滑膜炎癥及骨質破壞中起到重要作用，是使RA病變持續(xù)存在、遷延進展的關鍵因素。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一高度保守的應激蛋白家族，廣泛存在于原核細胞和真核

2、細胞中。HSP70是熱休克蛋白家族中最重要的成員，其基本功能是參與新生蛋白質的折疊、解聚、移位等，故有“分子伴侶”(molecular chaperone)之稱。長期以來，熱休克蛋白被認為是細胞內的蛋白質，只能在細胞內發(fā)揮功能。近年研究發(fā)現，HSP70能被釋放到細胞外環(huán)境中，稱為細胞外HSP70(extracellular HSP70)；而且細胞外HSP70可能作為免疫系統(tǒng)的“危險信號”，調節(jié)免疫細胞的功能，參與免疫性疾病的病理過程。近

3、年來研究發(fā)現，RA患者關節(jié)液中HSP70水平明顯升高。然而，RA關節(jié)液和血清中HSP70與RA活動性之間相關性如何?關節(jié)液中HSP70的來源和釋放機制是什么?細胞外HSP70對RA炎癥是否有影響?目前尚無相關研究。 本研究首先觀察了RA患者血清和關節(jié)液中HSP70水平的改變及其臨床意義；然后探討熱應激和TNF-α對細胞外HSP70釋放的影響及其機制；并從整體動物水平和細胞水平探討細胞外HSP70對RA的作用及其機制。主要的實驗結

4、果如下： 1、RA患者血清和關節(jié)液中HSP70的改變及臨床意義。 (1)類風濕關節(jié)炎(RA)患者血清中HSP70含量變化：RA患者血清中HSP70含量(2.84±1.16 ng/ml)明顯高于骨關節(jié)炎(OA)(0.74±0.34 ng/ml)和正常對照組(0.84±0.42 ng/ml)，并且活動期RA血清中HSP70含量(3.31±1.09 ng/ml)明顯高于非活動期RA(1.89±0.06 ng/ml)；RA患者血

5、清中HSP70水平與腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6水平呈正相關；RA患者血清HSP70的水平與血沉(ESR)、C-反應蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)呈正相關。(2)類風濕關節(jié)炎(RA)患者關節(jié)液中HSP70含量變化：RA患者關節(jié)液中HSP70含量(88.97±21.49 ng/ml)明顯高于OA組(33.13±17.27 ng/ml)，并且活動期RA(102.55±19.61 ng/ml)明顯高于非活動期RA(80.

6、36±10.88 ng/ml)；RA患者血清HSP70水平與TNF-α、IL-6、IL-10水平呈正相關。上述結果提示細胞外HSP70產生可能與RA炎癥刺激有關，也提示細胞外HSP70可能參與RA的炎癥過程，細胞外HSP70水平可以考慮作為RA患者的病情活動指標。 2、應激對成纖維樣滑膜細胞HSP70釋放的影響。 (1)熱應激對HSP70釋放的影響：成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte

7、s，FLSs)遭受不同溫度的熱休克(heat shock，HS)時，細胞內HSP70表達和細胞外HSP70釋放都明顯增加；重度HS引起HSP70釋放增多同時伴有乳酸脫氫酶(LDH)釋放增多；輕度HS也能誘導HSP70釋放，卻沒有明顯LDH釋放。(2)炎癥應激對HSP70釋放的影響：TNF-α能劑量和時間依賴性誘導成纖維樣滑膜細胞HSP70的表達和釋放增多，但是LDH釋放并沒有明顯增多。這提示多種應激可導致HSP70的主動釋放。(3)脂筏

8、在HSP70主動釋放中的作用：脂筏結構的破壞劑β甲基環(huán)狀糊精(methyl-β-cyclodextrin，MβD)處理成纖維樣滑膜細胞后能上調熱休克和TNF-α誘導的細胞內HSP70表達水平，同時MβD能劑量依賴性抑制熱休克或TNF-α所致成纖維樣滑膜細胞HSP70的主動釋放。以上研究表明，各種應激刺激，包括TNF-α能促進成纖維樣滑膜細胞HSP70的表達和主動釋放，而脂筏與成纖維樣滑膜細胞HSP70的主動釋放有關。 3、HSP

9、70對成纖維樣滑膜細胞炎癥細胞因子分泌的影響及機制。 (1)細胞外HSP70對成纖維樣滑膜細胞炎癥細胞因子分泌的影響：本研究用重組的人HSP70處理成纖維樣滑膜細胞，結果發(fā)現HSP70單獨處理不能影響促炎因子IL-6、IL-8和巨噬細胞趨化蛋白(MCP)-1的分泌，但能劑量依賴性抑制TNF-α所致成纖維樣滑膜細胞中IL-6、IL-8和MCP-1的分泌；HSP70能劑量和時間依賴性直接誘導抗炎細胞因子IL-10的生成；煮沸(100

10、℃)能消除HSP70對細胞因子分泌的影響，而多粘菌素B(polymyxin B，PMB)不能消除HSP70對細胞因子分泌的影響。以上結果表明細胞外HSP70通過抑制成纖維樣滑膜細胞促炎因子分泌和促進抗炎因子分泌而發(fā)揮抗炎作用，而且細胞外HSP70對細胞因子分泌的影響與內毒素污染無關。 (2)HSP70作用于成纖維樣滑膜細胞的受體類型：本研究首先通過RT-PCR和Western blotting實驗證實了Toll樣受體(toll-

11、likerecepfor，TLR)2和TLR4在成纖維樣滑膜細胞中的表達；采用專一針對抗TLR2或TLR4的單克隆抗體封閉成纖維樣滑膜細胞膜上TLR2或TLR4，發(fā)現抗TLR4抗體預處理廢除了HSP70對促炎細胞因子IL-6、IL-8、MCP-1和抗炎細胞因子IL-10分泌的影響，而抗TLR2抗體預處理卻不能廢除HSP70對上述細胞因子分泌的影響。以上結果表明細胞外HSP70對成纖維樣滑膜細胞炎癥因子分泌的影響是TLR4依賴性的，即成纖

12、維樣滑膜細胞表面TLR4可能是細胞外HSP70的受體。 (3)HSP70對炎癥信號通路的影響：重組的人HSP70能夠顯著抑制TNF-a所致JNK、ERK、p38 MAPK的活化；HSP70能夠抑制TNF-a所致IκB的降解和NF-κB p65的核移位；HSP70也能夠直接誘導STAT3的活化和SOCS3的表達。上述研究表明，細胞外HSP70通過抑制MAPK、NF-κB通路的活化及激活JAK-STAT3-SOCS3通路來調節(jié)炎癥細

13、胞因子分泌。 4、HSP70對膠原性關節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)動物模型的影響。本研究首先應用基因工程技術制備重組的人HSP70，然后在小鼠初次免疫膠原后的第28天出現關節(jié)炎時給予重組HSP70腹腔注射。結果顯示，HSP70能夠減輕CIA小鼠關節(jié)腫脹和降低關節(jié)炎評分；組織病理學檢查顯示HSP70能夠減少滑膜組織炎癥細胞滲出和骨質破壞。此外，HSP70明顯降低CIA小鼠血清中TNF-α和I

14、L-6水平。上述研究表明細胞外HSP70能夠緩解小鼠膠原性關節(jié)炎的炎癥，對RA具有治療作用。 綜上所述，RA患者血清和關節(jié)液中HSP70水平明顯升高，并且與RA疾病活動性和炎癥細胞因子之間存在相關性，提示細胞外HSP70產生可能與RA炎癥刺激有關，細胞外HSP70水平可作為RA疾病活動性的參考指標；熱休克或TNF-α誘導了成纖維樣滑膜細胞HSP70的主動釋放，而且HSP70的主動釋放與成纖維樣滑膜細胞膜上的脂筏結構有關，提示RA

15、患者關節(jié)液中高水平的HSP70可能來源于成纖維樣滑膜細胞受應激刺激后的主動分泌；重組人HSP70通過抑制成纖維樣滑膜細胞促炎因子IL-6、IL-8和MCP-1的分泌和促進抗炎細胞因子IL-10分泌來發(fā)揮抗炎作用；HSP70對細胞因子分泌的影響具有TLR4依賴性，提示成纖維樣滑膜細胞表面的TLR4可能是HSP70作用的受體；HSP70通過抑制MAPK、NF-κB通路和激活JAK-STAT3-SOCS3通路來調節(jié)成纖維樣滑膜細胞炎癥因子的分