UFPs通過肺泡上皮細胞自噬紊亂誘導肺纖維化的機制研究.pdf

1、我國經(jīng)濟的快速發(fā)展帶來了當前的空氣污染問題，特別是反復出現(xiàn)的霧霾，引起了政府和公眾的關注。霧霾主要由大氣環(huán)境中存在的顆粒物(Particulate matter,PM)引起，特別是空氣動力學直徑(AD)＜2.5μm的細顆粒物，一般稱為PM2.5。呼吸系統(tǒng)是顆粒物暴露的首要作用對象，流行病學研究顯示PM2.5與多種呼吸系統(tǒng)疾病相關，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等。一般認為，顆粒物的毒性與顆粒物的直徑密切相關，直徑越小，毒性越大，但當前對

2、超細顆粒物（AD≤0.1μm，ultrafine particle，UFPs）的健康危害研究不夠全面與深入。需要指出的是，真實環(huán)境中的顆粒物樣本成分復雜，直徑分布不一，研究結果不易重復且難以分析。因此，實驗室研究中常采用成分與直徑單一的人工合成顆粒物作為替代物。
　　肺纖維化是慢性肺疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理改變，表現(xiàn)為肺泡上皮細胞持續(xù)性損傷、成纖維細胞過度增殖活化、尤其是膠原過度沉積，最終能引起呼吸衰竭。肺纖維化的機制尚未完全

3、闡明，但認為由多種機制共同調控。早期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應是介導肺纖維化的關鍵機制，細胞因子釋放、氧化應激、成纖維細胞活化增殖在發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用;近期研究顯示，肺泡上皮細胞損傷同樣在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中扮演關鍵角色。已有動物實驗報道表明UFPs經(jīng)肺灌注后，能夠誘導小鼠肺纖維化，但其發(fā)病機制的研究仍停留在氧化應激、炎癥反應及細胞因子等方面，UFPs是否可以通過直接損傷肺泡上皮細胞而誘導肺纖維化？尚無文獻報道。為探索UFPs對肺泡上皮細胞

4、的作用及其在肺纖維化中的貢獻，本學位論文擬以人工合成的納米級顆粒模擬大氣中的UFPs，研究該顆粒物誘導的肺泡上皮細胞損傷機制及其在小鼠肺纖維化中的作用。
　　為此，本論文首先采用小鼠肺灌注模型模擬人體呼吸道顆粒物暴露過程，建立UFPs誘導肺纖維化模型。暴露1個月后，檢測小鼠肺功能并收集小鼠的肺組織進行后續(xù)檢測。呼吸功能檢測結果顯示，UFPs暴露顯著降低小鼠肺順應性;UFPs暴露后解剖小鼠，肉眼觀察可見肺部呈現(xiàn)彌散狀白色斑點，且明顯

5、增大，肺臟器系數(shù)顯著增加;Masson染色及天狼猩紅膠原染色表明，UFPs處理組小鼠膠原纖維的含量較對照組明顯增加;組織羥輔氨酸分析證明，UFPs處理增加小鼠肺組織中羥輔氨酸含量;qRT-PCR檢測CTGF基因的結果顯示，UFPs暴露上調其表達量;免疫組化結果表明，肺組織中α-SMA的表達量在UFPs處理之后顯著上調。以上結果充分證明，UFPs誘導小鼠肺纖維化的實驗模型已成功建立。
　　進一步，我們采用電鏡觀察UFPs在小鼠肺組織

6、中的定位，結果顯示二型肺泡上皮細胞可以吞噬顆粒物，且肺組織凋亡增加。為了證明動物水平的結果是正確的，我們對體外培養(yǎng)細胞進行UFPs處理，同樣觀察到肺泡上皮細胞攝取UFPs，并發(fā)生凋亡。以上結果表明UFPs能夠靶向肺泡上皮細胞，提示肺泡上皮細胞損傷與UFPs誘導的肺纖維化相關。細胞自噬是真核生物中一種依賴溶酶體降解胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及應對環(huán)境刺激中起重要作用，其紊亂已經(jīng)被證實參與了肺纖維化的多個過程。那

7、么，自噬是否參與UFPs誘導的肺纖維化呢？為此，在本論文的小鼠肺纖維化模型中，我們利用免疫印跡與免疫組化技術檢測了自噬相關分子，結果顯示自噬的主要分子標記物LC3-Ⅱ在UFPs暴露的小鼠肺組織中顯著上調，提示自噬可能參與了UFPs誘導的肺纖維化。
　　為了詳細闡明UFPs影響細胞自噬的分子機制，我們在細胞水平開展深入研究。以A549細胞為研究對象，本論文證實UFPs確實可以引起肺泡上皮細胞自噬泡聚集。進一步，我們?nèi)鏅z測了UFPs

8、對自噬流的三個過程，即自噬泡生成、自噬溶酶體與自噬泡融合、自噬溶酶體降解的影響。結果顯示，UFPs不影響自噬調控蛋白mTOR的活性，說明經(jīng)典的mTOR信號通路并未參與UFPs誘發(fā)的自噬泡聚集過程;免疫印跡檢測表明，UFPs處理并不促進自噬性降解底物蛋白p62的降解，反而增加細胞內(nèi)p62蛋白水平，提示自噬泡聚集源自于自噬性降解的抑制。一般認為，自噬泡形成之后，需要與溶酶體融合形成自噬溶酶體，繼而在自噬溶酶體內(nèi)完成對底物的降解過程。我們的結

9、果顯示，UFPs不影響自噬泡和溶酶體的融合，但能夠損傷溶酶體的降解能力。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，UFPs處理導致肺泡上皮細胞的溶酶體腫脹，抑制溶酶體的正常酸化，從而抑制酸性水解酶（如組織蛋白酶D）的成熟。采用外加cAMP回復UFPs引起的溶酶體酸化抑制，可以加快細胞的自噬流降解，減少UFPs誘導的細胞凋亡。此外，我們的實驗結果表明，UFPs可以上調A549細胞IL-1與IL-6的基因表達水平，而cAMP回復溶酶體酸化及rapamycin加快自

10、噬流均能夠下調IL-1與IL-6的水平，說明超細顆粒物引起的自噬紊亂還可以調控炎癥反應。現(xiàn)場采集的顆粒物樣本同樣能夠上調A549細胞中LC3，p62蛋白的表達，表明自噬流阻斷在真實暴露中同樣存在。
　　最后，本論文在動物體內(nèi)對細胞水平的研究結果進行了驗證。免疫印跡與免疫組化的結果表明，UFPs暴露上調小鼠肺組織中p62蛋白表達水平，說明體內(nèi)結果與體外一致，即UFPs抑制自噬性降解。進一步，在體內(nèi)采用rapamycin加快自噬流干預

11、UFPs誘導肺纖維化的過程后，檢測肺纖維化相關的表型。天狼腥紅染色結果表明，小鼠暴露UFPs后用rapamycin進行干預，膠原聚集顯著減輕;羥輔氨酸檢測結果顯示，rapamycin顯著下調小鼠肺組織中羥輔氨酸含量;此外，免疫組化結果可見rapamycin下調肺組織中α-SMA的表達量。以上結果充分證明rapamycin干預組小鼠肺纖維化明顯減輕，說明自噬流阻斷是UFPs誘導肺纖維化的發(fā)病機制。
　　根據(jù)以上結果，我們得出結論:U