SiRNA干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK-eIF2α通路在糖尿病腎病中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　PERK通過活化下游 eIF2α和Nrf-2兩條信號通路發(fā)揮促凋亡或抗凋亡效應，PERK內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路活化通過調(diào)節(jié)細胞凋亡參與多種疾病的發(fā)病。新近研究表明糖尿病腎病存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及PERK/eIF2α通路活化，然而，PERK/eIF2α通路活化與腎組織細胞凋亡間的關(guān)系尚不明確。本研究在證明糖尿病腎組織存在GRP78/PERK/eIF2α內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路活化，以及組織細胞凋亡增加的前期工作基礎(chǔ)上，擬采用RNA干擾技術(shù)下

2、調(diào)eIF2α和Nrf-2基因表達，通過體外實驗旨在明確：⑴糖尿病腎組織細胞凋亡與PERK/eIF2α和（或）PERK/Nrf-2信號通路活化的關(guān)系；⑵高糖和血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞凋亡，是否依賴PERK/eIF2α和（或）PERK/Nrf-2信號通路活化；⑶ eIF2α和Nrf-2何為誘導凋亡的關(guān)鍵分子。本項目的意義在于為糖尿病腎病治療篩選新的有效的分子干預靶點。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞（NRK-52E

3、），分別單獨轉(zhuǎn)染 eIF2α-siRNA、Nrf-2-siRNA慢病毒載體，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確定MOI值。轉(zhuǎn)染后的NRK-52E細胞加入高糖（30mmol/L）和不同濃度血管緊張素Ⅱ（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）刺激，觀察時間點為12h、24h、48h，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，篩選出血管緊張素Ⅱ的最佳作用濃度和最佳作用時間。實驗分為四組：正常對照組(血糖5.5mmol/L)、高糖和血管緊張素Ⅱ

4、刺激組、高糖和血管緊張素Ⅱ+空載體組、高糖和血管緊張素Ⅱ+SiRNA組。通過免疫組化和Western blot方法檢測腎小管細胞eIF2α、p-eIF2α，Nrf-2表達水平，采用TUNEL方法檢測腎小管細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1．熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光表達，轉(zhuǎn)染效率至少在80％以上，MOI值為10。
　　2．流式細胞術(shù)篩選出血管緊張素Ⅱ的最佳作用濃度為10-7mol/L，最佳作用時間為24小時。
　　

5、3．免疫組化和Western blot已經(jīng)證實，正常情況下NRK-52E細胞中存在eIF2α和Nrf-2的表達。在加入高糖、血管緊張素Ⅱ誘導細胞凋亡后，p-eIF2α的表達明顯增加（p<0.05），在 eIF2α-SiRNA干擾后，eIF2α、p-eIF2α的表達明顯受抑制（p<0.05）。在Nrf-2-SiRNA干擾后，Nrf-2的表達明顯受抑制（p<0.05）。
　　4．TUNEL結(jié)果中加入高糖、血管緊張素Ⅱ后 NRK52E細

6、胞凋亡增加，在eIF2α-SiRNA干擾后，細胞凋亡較正常對照組和高糖、AngⅡ組明顯減少（p<0.05）；在Nrf-2-SiRNA干擾后，細胞凋亡較正常對照組和高糖、AngⅡ組明顯增加（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．正常情況下，NRK52E細胞中存在 eIF2α和Nrf-2的表達，PERK/eIF2α信號通路在ERS反應中發(fā)揮促凋亡作用，PERK/Nrf-2信號通路在ERS反應中發(fā)揮抗凋亡作用。
　　2．高糖