miR-124介導(dǎo)ICAM-1對(duì)MCP-1的調(diào)節(jié)作用和對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響.pdf

1、動(dòng)物肺組織受到細(xì)菌和病毒感染時(shí)，機(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞會(huì)發(fā)生應(yīng)急反應(yīng)，以抵抗感染。但該應(yīng)急反應(yīng)過多，會(huì)引起肺組織損傷，導(dǎo)致肺部炎癥和急性肺損傷(ALI)，甚至?xí)?dǎo)致急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。免疫細(xì)胞在肺部的募集是一個(gè)有序的過程，中性粒細(xì)胞是第一波反應(yīng)的免疫細(xì)胞，感染后1～2小時(shí)在肺部募集。募集后的中性粒細(xì)胞，跨內(nèi)皮細(xì)胞層遷移進(jìn)入肺泡，釋放可對(duì)抗入侵細(xì)菌和病毒的物質(zhì)。單核細(xì)胞則是在感染24～48小時(shí)后第二波在肺部募集的免疫細(xì)胞，進(jìn)入肺組織

2、后的單核細(xì)胞可分化為巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。巨噬細(xì)胞可通過極化發(fā)揮促炎或抗炎作用，但目前在肺損傷中這種作用還不明確。
　　ICAM-1作為細(xì)胞的黏附分子，在中性粒細(xì)胞募集時(shí)表達(dá)迅速增加，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附在毛細(xì)血管壁上，穿越血管內(nèi)皮層而浸潤(rùn)到肺組織中。浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞及受影響的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，分泌單核細(xì)胞趨化因子MCP-1進(jìn)一步誘導(dǎo)單核細(xì)胞在肺組織的募集。miRNA(microRNA)是小RNA的一種，通過靶向mRNA降解或抑制蛋

3、白的翻譯，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，肺組織中miRNA可以影響MCP-1的表達(dá)，而ICAM-1是否能通過miRNA影響MCP-1的表達(dá)，目前還不是很清楚。本研究選取小鼠單核巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，試圖探討ICAM-1在肺組織中是否通過miRNA調(diào)節(jié)趨化因子MCP-1的表達(dá)，及其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.ICAM-1敲除對(duì)MCP-1和miR-124表達(dá)的影響
　　首先我們?cè)贗CAM-1敲除小

4、鼠的肺組織中，發(fā)現(xiàn)MCP-1的蛋白表達(dá)量增加。選擇小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)轉(zhuǎn)染ICAM-1的siRNA，細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)被抑制后，提高了MCP-1的蛋白表達(dá)。ICAM-1敲除的小鼠肺組織，經(jīng)小RNA測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)miR-124的表達(dá)顯著降低，RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果。
　　2.miRNA-124靶基因的驗(yàn)證
　　經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-124在小鼠肺組織的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-124能與MCP-1的

5、3'UTR序列互補(bǔ)結(jié)合，MCP-1是miR-124潛在的靶基因。構(gòu)建包含MCP-13'UTR的野生型、突變型和缺失型雙熒光素酶質(zhì)粒，經(jīng)熒光素酶活性分析，表明 MCP-1是miR-124的靶基因。miR-124模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞，RT-PCR和Western blot檢測(cè)MCP-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-124能抑制MCP-1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子SP-1對(duì)miR-124的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　為了研究miR-1

6、24表達(dá)的分子機(jī)制，克隆小鼠miR-124的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建于PGL3-Basic載體中，在小鼠單核巨噬細(xì)胞中驗(yàn)證其啟動(dòng)子的活性，通過熒光活性分析證實(shí)啟動(dòng)子pre-493區(qū)域內(nèi)含有激活miR-124轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。生物信息學(xué)分析結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)SP-1與miR-124可能結(jié)合的位點(diǎn)。經(jīng)轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)突變和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，確定了SP-1對(duì)miR-124的關(guān)鍵作用位點(diǎn)和兩者的相互結(jié)合。
　　4.miR-124、ICAM-1調(diào)控巨噬細(xì)胞極化

7、>　　LPS(2μg/mL)和IL-4（20ng/mL）分別處理小鼠單核巨噬細(xì)胞，構(gòu)建極化模型。我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞分化為M1型，IL-4誘導(dǎo)細(xì)胞分化為M2型。將miR-124的模擬物和ICAM-1 siRNA分別轉(zhuǎn)染單核巨噬細(xì)胞，檢測(cè)M1/M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子。我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和miR-124具有促進(jìn)M2型極化的作用，促進(jìn)標(biāo)志分子ym-1、Mrc-1和IL-10的表達(dá)。表明miR-124和ICAM-1具有抗炎作用，能抑制小鼠

8、單核細(xì)胞中的炎性反應(yīng)。
　　5.miR-124對(duì)動(dòng)物體內(nèi)肺損傷的作用
　　本研究通過LPS(10mg/kg)誘導(dǎo)體內(nèi)肺損傷的炎癥模型，確認(rèn)miR-124對(duì)肺損傷的作用。將miR-124(2OD)尾靜脈注射小鼠，RT-PCR檢測(cè)miR-124在肺組織中的表達(dá)增加。然后用LPS誘導(dǎo)小鼠肺損傷，檢測(cè)肺髓過氧化物酶活性(MPO)，與單獨(dú)LPS誘導(dǎo)的小鼠相比，miR-124抑制了MPO的活性，對(duì)肺損傷起到了保護(hù)的作用。
　　PR

9、RSV感染的豬肺組織中，我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和miR-124的表達(dá)上調(diào)，MCP-1的表達(dá)下調(diào)。表明在PRRSV造成的豬肺損傷組織中，ICAM-1、miR-124與MCP-1的表達(dá)負(fù)相關(guān)，積極參與豬肺組織中的炎癥反應(yīng)。
　　綜上所述，本研究通過對(duì)比野生型小鼠和ICAM-1敲除小鼠中MCP-1的表達(dá)，經(jīng)miRNA測(cè)序，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)潛在調(diào)控MCP-1的miRNA，闡明ICAM-1能通過miR-124調(diào)節(jié)趨化因子MCP-1的蛋白表達(dá)來