靜脈移植脂肪間充質干細胞治療甘油所致大鼠腎小管損傷的研究.pdf

1、一、背景：
　　 近年來原林教授等提出筋膜學假說認為:人體由非特異性結締組織筋膜支架所構成的支持與儲備系統(tǒng)和被筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所共同構成。支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細胞為核心,為功能系統(tǒng)的更新提供細胞補充,并為功能系統(tǒng)的各種細胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內部環(huán)境。脂肪組織是支持與儲備系統(tǒng)的重要組成部分,其中的脂肪間充質干細胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells,ADMSCs)是

2、機體重要的干細胞儲備之一。對ADMSCs深入研究,能對筋膜學假說提供部分理論支持,同時也是進行干細胞移植取材時應該考慮的問題。
　　 干細胞由于具有自我更新和多向分化潛能將成為重要的組織工程種子細胞,但由于胚胎干細胞、骨髓干細胞以及誘導的多潛能干細胞存在著倫理道德或免疫排斥反應,甚至有致瘤的危險性,而脂肪干細胞由于來源簡便充足,容易大量提取獲得,移植后無免疫排斥反應,將成為組織工程比較有前景的種子細胞。間充質干細胞具備成體干細胞

3、的特征,能無限傳代和多向分化。目前已經(jīng)從多種組織中分離出間充質干細胞,包括骨髓、脂肪、臍帶血、外周血和骨骼肌等。間充質干細胞中研究較為深入的是骨髓間充質干細胞,能在一定的條件下分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞和神經(jīng)細胞等,骨髓間充質干細胞是首先分離的間充質干細胞,已經(jīng)作為種子細胞在各種移植實驗中取得了明顯的效果。近期的研究發(fā)現(xiàn),同樣具有多向分化能力的ADMSCs和骨髓間充質干細胞相比具有取材手術小、可重復進行、酶消化分離程序

4、簡單等優(yōu)點,可作為新的成體干細胞來源。
　　 在當今社會,道路交通傷(RoadTraffioInjuryRTI)非常普遍,統(tǒng)計全世界每年約有120萬人死于道路交通傷,其中15-44歲的青壯年占一半以上。研究證實急性腎損傷(Acute Kidney Injury AKI)是創(chuàng)傷后嚴重并發(fā)癥。根據(jù)AKI定義和研究對象不同(如ICU或非ICU病人),創(chuàng)傷后AKI發(fā)生率為0.098-31.0％,死亡率高達13-78％,是造成傷員院內死亡

5、的重要原因。RTI是現(xiàn)代創(chuàng)傷最主要的組成部分,其中50-70％的創(chuàng)傷是由于道路交通事故造成。
　　 急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)為臨床常見的急危重癥,若不能早期診斷、及時處理,常會造成不可逆的腎臟損害。急性腎損傷是一個多因素參與的病理生理過程,其發(fā)病機制非常復雜并且至今尚未完全明了。近年來,急性腎損傷的發(fā)病率及死亡率并沒有隨著醫(yī)療水平的提高而下降。如何防治并早期干預急性腎損傷已成為基礎和臨床腎臟病

6、學者研究的重要課題。近年來干細胞移植治療給腎損傷的治療帶來了希望,許多學者進行了大量的實驗研究。細胞移植治療腎損傷的機理可能是促進了神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,減少了炎癥反應,或者是替代了損傷的腎細胞。我們研究的內容是靜脈移植ADMSCs能否促進大鼠腎損傷的恢復以及對營養(yǎng)因子的影響。
　　 二、目的：
　　 1、分離培養(yǎng)SD大鼠的ADMSCs,并進行表面標志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的檢測,

7、進行成骨成脂誘導檢測多向分化能力；
　　 2、不同月齡獲得的ADMSCs在成骨成脂分化能力定量測定、增殖能力、收獲率、增殖能力測定；
　　 3、靜脈移植ADMSCs能否促進甘油所致大鼠腎小管損傷大鼠的腎恢復,能否遷移到損傷區(qū)域以及對局部炎癥因子有無影響。
　　 三、方法：
　　 1、ADMSCs的分離培養(yǎng)、多向分化、表面標志鑒定
　　 從6只SD大鼠腹股溝脂肪墊中分離培養(yǎng)ADMSCs。先將脂肪組織

8、剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化,離心將上層脂肪細胞從間質血管碎片中去除,然后以8000-10000cells/cm2的密度種植于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM。24h后,換液去掉未貼壁細胞,貼壁細胞用來擴增傳代。相差顯微鏡下觀察ADMSCs的形態(tài)。
　　 取第4代ADMSCs進行成骨和成脂誘導分化,經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基誘導周后用茜素紅染色檢測礦化結節(jié)。經(jīng)成脂誘導培養(yǎng)基誘導4周后用油紅O染色檢測脂質沉積。

9、r>　　 用流式細胞術鑒定第4代的ADMSCs的表面標志物:CD14、CD29、CD45、CD44和CD105的表達率。
　　 2、皮下ADMSCs的獲取
　　 8只SD大鼠取腹股溝脂肪墊,培養(yǎng)擴增ADMSCs。相差顯微鏡下觀察兩個部位來源的ADMSCs的形態(tài)。分別取兩種來源的第4代ADMSCs進行成骨和成脂誘導分化。每只大鼠來源的第4代腹股溝ADSCs種植于6孔板,成脂定量方法:成脂誘導后用油紅O染色檢測細胞內脂質沉

10、積。成骨定量方法:ADMSCs成骨誘導后用茜素紅染色用10％西吡氯銨洗脫。
　　 3、靜脈移植ADMSCs對腎小管損傷的影響
　　 腎模型的建立大鼠置于籠中,記錄正常飲水量及尿量。大鼠給予50％甘油生理鹽水10ml/kg,雙后肢肌肉注射。靜脈移植脂肪間充質干細胞:SD大鼠ADMSCs擴增至第四代。用第4代ADMSCs在進行移植,培養(yǎng)3天后消化收集,用生理鹽水重懸,300萬/ml。實驗組大鼠腎損傷6h后行ADMSCs尾靜脈

11、移植,每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射間充質干細胞3×106個。
　　 四、結果：
　　 SD大鼠ADMSCs呈現(xiàn)類似成纖維細胞樣形態(tài)學特征。1到4代ADMSCs在倒置顯微鏡下觀察,經(jīng)過傳代后細胞形態(tài)逐漸均一,類似成纖維細胞,多呈長梭型或者紡錘形。用第4代ADMSCs進行成骨和成脂誘導分化,經(jīng)誘導后能向成骨細胞和脂肪細胞轉化。成脂培養(yǎng)基內誘導兩周后,部分內脂滴積聚。細胞在培養(yǎng)皿上展開,脂滴占據(jù)細胞大部,胞核被擠于一側。油紅O染色顯示

12、特異性的紅色脂滴。成骨誘導后細胞逐漸聚集,并可重疊生長,兩周后可見細胞外大量鈣質沉積,礦化結節(jié)被茜素紅染成紅色的致密結節(jié)。免疫表型分析顯示CD29和CD105呈陽性,而CD14、CD44和CD106呈陰性反應。
　　 4代ADMSCs表面標志中CD14、CD44和CD106均呈低表達,CD29和CD105呈高表達。
　　 五、結論：
　　 1、通過這種酶消化方法獲得的SD大鼠ADMSCs具有成骨、成脂、成軟骨多向