大腸桿菌O157-H7和單增李斯特菌主要毒力因子多重熒光定量PCR檢測方法的建立和應用.pdf

1、腸出血性大腸桿菌的主要致病菌株為O157:H7，同時也是與公共衛(wèi)生有關的最重要的出血性大腸桿菌的血清類型。大腸桿菌O157:H7在感染宿主后，主要可引發(fā)感染性腹瀉、出血性結腸炎、血栓性血小板減少性紫癜、腎溶血性尿毒綜合征等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導致死亡。與大腸桿菌O157:H7一樣作為四大食源性致病菌之一的單增李斯特菌，在感染宿主后主要表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、神經系統(tǒng)損傷、流產和單核細胞增多等。本研究通過對大腸桿菌O157:H7和單

2、增李斯特菌的毒力因子的研究，建立了多個實時熒光定量PCR反應體系，并將其初步應用到實際檢測中，為進一步研究和監(jiān)控這兩種菌奠定基礎。試驗分為以下四個部分:
　　試驗Ⅰ大腸桿菌O157:H7多重熒光定量PCR檢測方法的建立
　　根據GenBank公布的大腸桿菌O157:H7的菌體抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素hlyA基因、緊密粘附素eaeA基因和志賀毒素1、2基因序列進行同源性比較分析，選擇保守序列用軟件Prim

3、er Express5.0分別設計6對特異性的引物及相應的Taqman探針，rfbE/eaeA、Stx1/hlyA、fliC/Stx2探針5'端分別標記為FAM、HEX、CY5熒光報告基團，3'端都標記為BHQ1熒光淬滅基團。通過優(yōu)化反應體系和程序，得到優(yōu)化的三個測試屬性（檢測時間、特異性和靈敏度），建立2個能夠快速、特異性地檢測大腸桿菌O157:H7及其4個主要毒力基因的三重熒光定量PCR。結果顯示:該方法靈敏度高，目的基因Stx1、

4、rfbE、fliC、eaeA、hlyA、Stx2片段長度分別為108bp、87bp、86bp、125 bp、141 bp、118 bp，重組質粒最低檢測限分別約為20、30、20、20、30、40拷貝數(shù)/μL;特異性試驗證明該菌與其他菌種無交叉反應;具有較好的重復性，變異系數(shù)均小于2％;檢測過程耗時約1h。以上結果表明本研究所建立的三重熒光定量PCR方法的敏感性、重復性及特異性均較好，可作為同時快速檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7及其

5、毒力基因的方法。
　　試驗Ⅱ單增李斯特菌單項熒光定量PCR檢測方法的建立
　　根據GenBank公布的單增李斯特菌的毒力基因hlyA序列，選擇保守序列設計一對特異性引物及相應的Taqman探針，探針5'端標記為FAM熒光報告基團，3'端標記BHQ1熒光淬滅基團。構建陽性重組質粒hlyA進行熒光定量PCR檢測，通過優(yōu)化反應體系和程序建立單項熒光定量PCR方法，分析其靈敏度。結果顯示:該方法靈敏度高，最低檢測限為70拷貝數(shù)/μL

6、;特異性試驗證明該菌與其他菌種無交叉反應;具有較好的重復性，變異系數(shù)均小于2％;檢測過程耗時約1h。該法對陽性重組質粒hlyA定量擴增所建立標準曲線的相關系數(shù)為0.998。以上結果表明該方法特異性強、敏感性高，可為肉和肉制品中快速、準確的定量檢測李斯特菌奠定基礎。
　　試驗Ⅲ大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌多重熒光定量PCR檢測方法的建立
　　根據單增李斯特菌的hlyA基因與大腸桿菌O157:H7的rfbE、Stx1、f

7、liC、Stx2、eaeA、hlyA基因設計的引物和對應的TaqMan探針，以兩種菌的重組質粒為模板，建立大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌這兩種菌的多重實時熒光定量PCR檢測方法。結果顯示:當選擇的通道不同時，通過熒光定量PCR檢測，兩種菌的特異性基因能夠在同一反應體系中檢測到，說明本試驗成功建立了同時檢測大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌的TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法。
　　試驗Ⅳ大腸桿菌O157:H7和單增李斯

8、特菌人工污染豬肉樣品的檢測
　　根據本研究中大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌設計的引物和對應的TaqMan探針，以及建立的大腸桿菌O157:H7多重實時熒光定量PCR和單增李斯特菌單項實時熒光定量PCR檢測方法，將這些檢測方法應用到人工染菌模擬豬肉樣品的檢測中。結果顯示:無需富集或富集8h后測得大腸桿菌O157:H7的最低檢出限分別為200CFU/mL與1 CFU/mL，而單增李斯特菌分別為200 CFU/mL與5 CFU/m